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小金海棠的种质资源与开发利用 小金秋海棠是珍贵的苹果物种资源。它具有抗盐、抗旱性、抗旱性、抗旱性和抗寒性，对苹果属植物和潜在病毒有一定的抗逆性。同时，小金海棠也是全球范围内筛选出的第一个抗缺铁黄叶病苹果基因型。用小金海棠作砧木嫁接亲和性好，有矮化效应，具有高度的无融合生殖特性。山荆子(Malus baccata Borkh)是中国苹果生产中重要的砧木资源之一，但也是苹果属植物中极易发生缺铁黄叶病的种类。如何利用上述两种资源的优良基因开展苹果砧木育种，对中国的苹果生产具有重要的理论和实践价值。 DNA分子标记是以生物体的核酸多态性为基础的遗传标记，能直接反映生物在DNA水平上的遗传变异。各种DNA分子标记，例如RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeat or Microsatellites，简单重复序列或称微卫星）、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat）等，目前已在果树分类、品种鉴定、系谱分析、遗传图谱构建、基因标记、分子标记辅助育种等多方面得到广泛的应用。在众多的DNA分子标记中，RFLP和AFLP标记稳定性好，重复性强，适用于苹果品种鉴定和亲本分析，但这两种标记操作程序复杂，成本较高。相比较而言，SSR标记操作简单，具有高度的重复性、相对简单的带型和共显性遗传模式，是一种非常稳定可靠的DNA指纹技术。但对于大多数物种而言，微卫星两翼序列信息的缺乏限制了SSR的广泛应用。尽管ISSR可以用SSR作引物结合位置对微卫星之间的区域进行扩增，但ISSR确定退火温度比较复杂，除了根据计算Tm值的经验公式推算外，有些工作者还是凭自己的经验。纵观现有的DNA标记，RAPD是一种简单、经济、高效和实用的分子标记技术。与其它DNA分子标记比较，RAPD标记具有以下特点：1)对所需设备要求不高，操作简单，成本经济，分析检测手段简单；2)使用随机引物（不用预先知道研究对象的基因组核苷酸序列来设计引物），对于研究那些复杂的对象尤为有用；3）没有种的特异性，不同的物种可用同一组引物进行研究。因为这些优势，近年来RAPD标记在果树杂种鉴定方面，尤其是体细胞杂种鉴定方面得到大量应用。尽管许多研究表明只要严格控制RAPD技术各个环节就可获得一致的扩增产物，但RAPD技术的稳定性仍然是一个长期有争议的问题。 笔者运用RAPD和SSR分子标记对小金海棠和山荆子的F1代杂交实生苗进行早期鉴定，并通过对SSR标记和RAPD标记鉴定结果比较，对RAPD标记的不稳定性问题进行研究,为利用RAPD标记可靠地鉴定果树杂种实生苗提供新的信息和依据。 1 材料方法 1.1 实生苗的采集 杂交实验在前西南农业大学苹果种质资源圃进行。2002年4月中旬，采集山荆子花粉，以小金海棠作母本进行杂交（小金海棠×山荆子）。2002年9月，采集种子并对其进行层积处理后于2003年春播种，按常规管理，共获得F1代杂交实生苗79株。2004年6月，分单株采集叶片79份（编号为BX1到BX79）。另外，采集母本小金海棠叶片3份（编号为MX1到MX3），父本山荆子叶片2份（编号为MB1和MB2）。全部叶片用硅胶快速干燥，用于室内DNA提取。 1.2 rapd扩增 DNA提取方法采用常规CTAB法。RAPD随机引物（表1）购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PCR扩增反应体系为25μl，其中包括：约10 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg Cl2,dNTP各0.1 mmol/L,50mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCl(pH=9.0,25℃)，0.1%Triton X-100,0.2μmol/L引物，1U Taq DNA聚合酶（华美生物工程公司）。RAPD扩增程序：94℃预变性4min;94℃15s,37℃45s,72℃90s，循环39次；72℃延伸4min。扩增产物（10μl）检测，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，缓冲液为1×TBE，在4V/cm恒压下电泳2h，溴化乙锭（EB）染色，Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。 1.3 pcr扩增程序 SSR分析引物根据Guilford和Gianfranoschi，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表2）。PCR扩增反应体系为10μl，包括模板DNA约10ng、1.5 mmol/L Mg Cl2、dNTP各0.2 mmol/L、50 mmol/LKCL、10 m