两种国际位点串联重复序列分析方法用于我国鼠伤寒沙门菌mlva分型的比较.docxVIP

两种国际位点串联重复序列分析方法用于我国鼠伤寒沙门菌mlva分型的比较 老鼠伤寒沙杆菌是常见的食源性病原体之一，通常表现为胃肠炎。随着食品生产、加工及供应的集中化,工业化,大批量生产的被沙门菌污染的食品食物中毒事件。目前每年国际上包含我们国家在内都会有沙门菌引起的食物中毒事件的报道,特别在美国、欧洲等发达国家,这种暴发以越来越散在的病例形式出现,使污染源及传播途径的发现越来越依赖于分子分型手段的辅助及确认。快速、敏感的分子分型方法对提高暴发的早期发现具有重大公共卫生意义。随着第二代分子分型技术多位点VNTR分型的成熟,美国与欧洲分别发展了针对鼠伤寒沙门菌多位点串联重复序列分析(MLVA)方法,前者在国际PulseNet上发布了包含7个VNTR位点的标准方案,后者则仅使用其中的5个位点在欧洲食源性疾病监测网中进行鼠伤寒沙门菌的监测,并成功进行了多起由鼠伤寒沙门菌引起的食源性疾病暴发的溯源调查。 近几年的监测发现鼠伤寒沙门菌是我国临床较常见的沙门菌致病血清型,由其引起的食物中毒较其他血清型更常见。为发展我国鼠伤寒沙门菌快速分子分型能力,评价上述两种MLVA分型方案在我国的适用性,本研究选取不同地区、不同省份来源的175株鼠伤寒沙门菌,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)及两种MLVA分型方法进行分型研究,并结合流行病学资料进行分析,以期建立一种适用于我国鼠伤寒沙门菌分离株的快速、操作方便的分子分型方法。 1 材料和方法 1.1 患者菌株的收集 鼠伤寒沙门菌共175株,其中160株分别来源于2006-2008年上海、四川、广西、河南、重庆5省(自治区、直辖市)疾病预防控制中心(CDC)沙门菌监测项目中收集的患者菌株,15株来源于食物皮蛋。 1.2 酶切处理和聚类构建 所有鼠伤寒沙门菌参照国际实验室分子分型监测网络PulseNet中沙门菌PFGE分型标准化方案进行操作。使用限制性内切酶XbaⅠ进行酶切,获得的菌株PFGE图像录入BioNumerics(Version5.1,Applied maths,Inc.)软件包进行处理,经校准后,使用非加权配对算术平均法(unweighted pair group average method,UPGMA)进行聚类,构建聚类树,分析菌株间的相似性。 1.3 荧光因子位点pcr和毛细管电泳检测vntr 分别参照国际实验室分子分型监测网络PulseNet和欧洲食源性疾病监测网公布的鼠伤寒沙门菌MLVA分型标准方案(分别简称为MLVA_PN和MLVA_EU),采用7个和5个VNTR (无ST2-ST3) 位点,合成相应引物(表1),并在引物5′端标记荧光基团,对175株鼠伤寒沙门菌进行PCR扩增,扩增产物使用ABI3700测序仪进行毛细管电泳检测,根据扩增片段大小计算每个VNTR位点的重复数。并将数据录入BioNumerics软件包进行分析。构建MLVA分型结果的最小生成树(minimum spanning tree,MST),构建参数为creation of complex:1 changes。 1.4 分辨系数的测定 在评价某种分型方法的分辨能力时通常采用基于Simpson的分辨系数,即D值来表示。其公式是: D=1?1N(N?1)∑j=1Snj(nj?1)D=1-1Ν(Ν-1)∑j=1Snj(nj-1) 其中N表示菌株总数,nj为某一型别的菌株数。 2 mlva分型结果的比较 MLVA分型方法对鼠伤寒沙门菌的分辨能力明显高于PFGE。175株鼠伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切,PFGE分析后,获得56种带型,每种带型包含1～55株菌株(图1)。3株(含)以上带型有11种,其中优势带型JPXX01.CN0001 55株,主要包括重庆8株、四川39株、上海8株,分别来自不同年代的腹泻患者粪便;次优势带型JPXX01.CN0006 16株,分布于广西、河南、上海;13株JPXX01.CN0073 型,全部为河南菌株。此外,来自河南2007年的44株菌中40株明显聚集成一簇(图1中虚线框所示),提示菌株具有一定的地域聚集性,但其他地区来源的菌株则未发现此现象。 应用MLVA_PN的7个VNTR位点进行分析,获得98种型别(图2), 平均每种带型包含1.8株菌。3株(含)以上带型有8种,其中优势带型0069 19株,主要分离自不同年代的患者菌株,包括广西6株、河南7株、上海6株;次优势带型0033 14株,其中13株为2008年四川皮蛋菌株。 应用MLVA_EU的5个VNTR位点进行分型,结果获得96种型别(图2),平均每种带型也包含1.8株菌。与MLVA_PN相比,除3株菌分型结果不一致外,其他菌株分型结果均完全一致(图3)。MLVA_EU分型结果中3株(含)以上的8种带型,分别对应MLVA_PN中的8个型别,如优