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液相色谱与质谱联用技术在方剂研究中的应用 作为一个极其复杂的化学物质体系，该处方的所有化学成分构成了从无机物到有机物、从离子型到强极性、从分子到大事、从异质和痕迹的化学成分。当该复杂系统作用于同样复杂的人体系统时,两者之间的相互作用和相互关系更是多层次、多因果的,其效应的产生必定是基于对整体水平上的调控机制,因此不可能以方剂中部分化学成分来完全阐释。从方剂作用的整体观出发,对其复杂的化学物质体系实现快速的分离分析是进行方剂现代研究的关键,而色谱-质谱联用技术的出现一定程度上解决了这一难题。 液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)是以高效液相色谱为分离手段,以质谱为鉴定工具的一种分离分析技术。它将高效液相色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有的高选择性、高灵敏度以及能够提供分子量与结构信息的优点结合起来,日益成为方剂复杂体系研究的强有力的分析技术支撑。本文综述了LC-MS技术在中药方剂研究中效应成分的结构鉴定、定性定量分析、方剂配伍规律研究以及方剂代谢产物鉴定和药动学研究等方面的应用进展,并分析了其存在的问题及应用前景。 1 质谱分级粉碎法 LC-MS一般采用软电离技术,常用的接口是电喷雾(ESI)、大气压化学源(APCI)等电离源,化合物在这些离子源作用下发生离子化及裂解的方式与EI有着明显的差异,可给出分子量及特征碎片等信息,特别是质谱多级碎片扫描(MSn)可使母离子进行多级碎裂,并由此提供复杂基质离子碎裂过程中彼此间的亲缘关系,为了解化合物的结构特征提供重要的信息。LC-MS技术在中药研究中的广泛应用,应以阐明各类型化合物在ESI、APCI等离子源内的质谱裂解规律为基础,才能将方剂效应物质研究更加深入,因此对中药中各类型化合物的裂解规律研究显得尤为重要。 1.1 糖苷结构分析 Fang等采用电喷雾串连质谱(ESI-MSn)技术对从白蒺藜中分离得到的两种甾体皂苷进行了研究,根据多级串连质谱实验数据,证实其中一种皂苷是tribulosin,并且推断了另一种未知的皂苷部分化学结构。同时,观察到许多甾体皂苷的特征碎片离子峰,根据碎片离子峰的裂解规律发现了有关糖基连接位点的信息。 Liu等采用(ESI-MSn)研究了人参和白蒺藜中皂苷在正离子和负离子模式下的裂解规律。皂苷分子在ESI-MS质谱中,阳离子模式下的主要离子峰为[M+Na]+,阴离子模式下的主要离子峰为[M-H]-。多级串连质谱给出了详细结构的信息,根据糖苷裂解得到的碎片离子峰可以获得苷元分子量,寡糖分枝链中单糖的连接顺序等信息。根据糖链中某一单糖环的跨键裂解得到的碎片离子峰可以推测出糖之间的连接位点。实验还发现不同的碱金属可以使裂解的程度有所不同。 1.2 ms2生物碱裂解途径 Wang等采用ESI-MSn研究了北草乌中乌头碱类生物碱的裂解规律,结果表明:在低能碰撞诱导裂解(CID)中,该类生物碱裂解途径有一定的相似性。在MS2中主要的裂解方式是乙酸基、脂肪酸基等作为C-8位上的取代基团的丢失,在MS3中则相继丢失CH3COOH/CH3OH/H2O/BzOH/CO。WU等采用ESI-FT-ICR-MS与HPLC-ESI-MSn技术对4种双异喹啉生物碱的裂解规律进行了研究。 1.3 电喷雾条件下叶片离子情况 白玉等采用ESI-MSn对苦参中黄酮类化合物二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物的特征质谱行为进行研究发现:两类化合物在电喷雾多级串联质谱条件下均可以在C环发生开环断裂,但断裂的位点不同。二氢黄酮类化合物断裂位点为C2-O键和C4-C10键,二氢黄酮醇类化合物断裂点为C2-O键和C3-C4键,此外,二氢黄酮醇类化合物在电喷雾条件下容易失去H2O、CO和CO2等分子,且B环和C环的连接键C2-C1易发生断裂而丢失B环。结构相近的这两类化合物在电喷雾条件下生成的碎片离子有很大差异的主要原因是在于二氢黄酮醇类化合物C环上3位-OH的影响。 林彤等运用HPLC-ESI-MS/MS联用技术共分析了苏薄荷提取物中的8个黄酮类成分,鉴定出了香叶木素、橙皮苷、香叶木素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷和椴树素5种成分,推测了2个黄酮苷和1个黄酮苷元的可能结构。对这类成分的裂解规律研究表明,黄酮苷类成分在一级谱中丢失糖基后形成苷元的碎片离子,苷元离子在二级谱中丢失CH3、CO及经RDA裂解产生各级碎片离子。 陈貌连等采用ESI-MSn鉴定出刺五加叶中4种黄酮类化合物:槲皮素、槲皮苷、金丝桃苷和芦丁,4种化合物都是苷元为槲皮素的黄酮醇类,并以金丝桃苷为例分析了黄酮醇苷类化合物在ESI-MSn条件下的裂解规律,结果表明裂解主要发生在C环上,其它碎片离子主要通过重排丢失中性的CO、CO2形成。窦建鹏等采用H/D交换的实验方法,并运用电喷雾碰撞诱导解离技术,分别阐明了淫羊藿苷在正、负离子模式下的电喷雾质谱碎片离