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超微粉对柳松菇多糖的凝胶柱层析分离研究

0主要功效成分

刘松蘑菇又名刺槐、沙丁鱼、柳蘑菇和柳环菌，属于担子菌纲、大便锈迹科学和蘑菇科。这是一种非常有发展前途的药物。这类菌不仅具有很高的营养价值，而且还含有许多生物活性物质，如糖、麦角固醇和黄酮。服药以治疗水肿、尿便、尿失眠症等。该菌株的亲水提取物在180例克隆和艾氏腹部疾病中的抑制率分别为90%和80%。这个数字的糖可以改善你的肌肉的疲劳，并具有明显的降血糖作用。然而，目前国内外对柳松蘑菇的研究主要集中在栽培和育种上，对其疗效成分的研究很少详细报告。糖是柳松蘑菇的主要药物种类之一。在这项工作中，我们使用传统的碎粉法提取多余的糖，并对不同粉碎程度提取的糖和糖进行分层处理，为柳松蘑菇及其功能因素的开发提供理论依据。

1材料和方法

1.1改性前后样品的制备

柳松菇子实体,来源于苏州市华昌食用菌有限公司.经低温烘干后加工粉碎成3~5mm3块状、40目粗粉、100目细粉及300目超微粉四种规格用于实验.块状和40目细粉在本公司加工,100目细粉和300目超微粉在东台市菇神食用菌研究所加工.粉碎后的样品均通过OLYMPUS(CH型)显微镜检查其粉体粒径的大小.

SephadexG-200、葡聚糖(Dextran)T500、T70、T40、T10为Pharmacia产品,考马斯亮蓝G250(Fluka产品),牛血清白蛋白(Sigma产品),其他试剂为国产分析纯或生化试剂.

蛋白沉淀剂为220g/L乙酸锌溶液和106g/L亚铁氰化钾溶液.

1.2实验方法

1.2.1不同粉碎程度的柳松菇多糖制备

取4种不同粉碎程度的样品按1∶40(W/V)的比例加入蒸馏水于500mL三角烧瓶内,搅拌均匀,100℃恒温水浴中回流提取1h,4000r/min离心10min,收集上清液,沉淀再按1∶20(W/V)的比例加入蒸馏水,混合均匀后,按上述条件再提取两次.分别各取3次提取液2.0mL,加4倍95%乙醇沉淀粗多糖,粗多糖经80%乙醇洗涤离心后,用于多糖测定.将三次提取液合并,测定其总糖和还原糖,把提取液浓缩至一定体积后按50∶1∶1(提取液∶乙酸锌溶液∶亚铁氰化钾溶液)的体积比例加入蛋白沉淀剂,混匀,静置30min后,离心去除蛋白质,取上清液浓缩至一定体积,加入4倍体积的95%乙醇,于冰箱内静置过夜,4000r/min离心10min,弃上清液,沉淀用80%乙醇洗涤离心3次,将所得沉淀冻干后分别得到4种不同粉碎程度提取的柳松菇多糖,用于实验分析.

1.2.2葡聚糖多糖质的提取

还原糖采用DNS法测定,总糖和多糖采用硫酸-蒽酮法测定.其中多糖测定改进如下:取多糖样品溶液和不同浓度葡聚糖溶液各0.4mL于试管中,用1mL的移液器吸1.00mL蒽酮试剂后直接打入到试管中的溶液内,立即混匀后于100℃保温10min,用0.5cm光径的比色皿在722型光栅分光光度计上读取620nm的吸光度值,以吸光度值对葡聚糖质量(μg)进行线性回归,求出回归方程及相关系数,将样品吸光度值代入回归方程后即得样品的多糖质量.

1.2.3蛋白质含量测定

取冻干多糖样品10.0mg,加蒸馏水溶解定容至10ml,配成浓度为1.0mg/mL的柳松菇多糖溶液,按硫酸-蒽酮法测定多糖含量,按Brecdford法或folin-酚法测蛋白质含量.同时在TU-1800型紫外可见分光光度计上进行波长扫描检测280nm和260nm的吸收值.

1.2.4层析分离多糖

多糖采用SephadexG-200凝胶柱层析(40×1.5cm)分离.取柳松菇多糖加0.4mL生理盐水充分溶解,加到用生理盐水充分平衡过的SephadexG-200凝胶柱上,用生理盐水进行洗脱,用BS-160A型自动部分收集器进行分部收集(4管/h,0.75mL/管),用硫酸-蒽酮试剂检测收集管糖含量,以葡萄糖含量为纵坐标,收集管号为横坐标绘制层析曲线图.

根据层析曲线图将多糖峰部分分别合并,浓缩后加4倍体积的95%乙醇沉淀,离心收集沉淀后得到每个峰的多糖,将多糖溶解后再进行一次SephadexG-200柱层析分离,得到单一对称的多糖峰,将多糖峰合并加4倍体积的95%乙醇沉淀,即得到层析后纯多糖Ⅰ和Ⅱ两个多糖组分.

1.2.5相对分子质量的测定

分别称取相对分子质量为50万、7万、4万、1万的葡聚糖各2mg左右,用少量生理盐水溶解,进行SephadexG-200柱层析,检测收集管糖含量,计算出不同分子量葡聚糖的洗脱体积,以洗脱体积对葡聚糖相对分子质量对数进行线性回归求出回归方程.将纯多糖Ⅰ和Ⅱ分别溶解后,在相同条件下进行凝胶柱层析,求出其洗脱体积,代入回归方程得到柳松菇多糖的相对分子质量.

2结果与分析

2.1显微观察和显微测量

在OLYMPUS显微镜(目镜×10,物