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载脂蛋白e基因敲除小鼠动脉粥样硬化病理分析

脂蛋白e基因（apollo营养元素e）可通过添加大鼠（脂蛋白e-老鼠）来严重的高胆固醇血症，并自发形成动脉粥样硬化（as）。这些斑点的分布和病理特征与人类as点非常相似。这是研究as病史和干预效果的良好动物模型。本实验动态观察了不同饮食对载脂蛋白E基因敲除小鼠As进展的影响。

1材料和方法

1.1血脂和糖代谢糖

载脂蛋白E基因敲除小鼠,6周龄,雌雄各半,由北京大学医学部实验动物科学部提供。胆固醇(totalcholesterol,TC),批号:010116;甘油三酯(triglyceride,TG),批号:010126;由北京中生生物工程高技术公司生产;高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoprotein,HDLC),批号:010212;低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoprotein,LDLC),批号:010215;由北京利德曼生物化学技术有限公司生产。

1.2胆固醇3%

20只载脂蛋白E基因敲除小鼠给予高脂膳食结构的饲料饮食(脂肪21%、胆固醇0.15%);20只载脂蛋白E基因敲除小鼠给予普通饲料饮食,饮水不限。分别在饲养15周龄、19周龄、24周龄、28周龄、36周龄时随机各取5只处死,处死前一天晚上禁食不禁水。

1.3测定项目和方法

载脂蛋白E基因敲除小鼠麻醉后,经眼眶采血,分离血清,测定血脂。TC采用CHOD-PAP方法测定;TG采用GPO-PAP方法测定;HDLC和LDLC采用直接测定法;以上血脂测定用全自动生物化学仪,仪器型号:RX-2000,美国TECHNICON公司生产。

1.4血管固定的方法

动物采血后,麻醉处死小鼠,取出心脏及主动脉,用生理盐水冲洗干净,从主动脉根部开始取材,剪下1～1.5cm的血管放入10%甲醛中固定。常规石蜡包埋,从主动脉根部0.2cm起间断均匀切片,切片厚度为5μm,每个血管取5张切片进行苏木素—伊红染色(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,普通光镜观察形态学改变,显微镜—微机彩色图像处理系统测量相关病理指标。

1.5切片测量指标

每间隔5张切片取1张进行HE染色,普通光镜观察血管及斑块的形态结构,进行病理形态学描述;每个标本共取3张切片用ImageProPlus4.5显微镜—微机彩色图像处理软件测量,测量指标包括:血管管腔面积(LA,指血管内膜所包围的血管管腔面积)、斑块面积(PA,每张切片所有斑块面积之和)和斑块面积与管腔面积之比(PA/LA)。

1.6统计学处理

采用SPSS软件(12.0版)进行统计学处理。数据用xˉ±sxˉ±s表示,计量资料前后对比采用配对t检验,组间对比采用单因素方差分析,计数资料用χ2检验,以P0.05作为显著界限。

2结果

2.1普通饮食饮食小鼠tc水平比较

载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂水平自发升高,与时间密切相关,但与时间并不绝对成正比;高脂膳食会加速高脂血症的形成。普通饮食组小鼠TC水平从15周龄时6.20±0.63mmol/L上升到36周龄时16.06±0.56mmol/L,且均较同时期高脂膳食饮食小鼠的TC水平低;高脂膳食组小鼠TC水平从15周龄时11.58±1.16mmol/L增至36周龄时24.01±1.58mmol/L(P0.05,P0.01)(表1,Table1)。

2.2纤维斑块的形成

光学显微镜下,15周龄普通饮食组小鼠内膜有钝角,缺乏连续性,主要病理改变为内膜增厚、脂质沉积,管腔内径未见异常。15周龄高脂饮食组小鼠3只有纤维斑块形成,2只有脂质条纹形成,纤维斑块有比较完整的纤维帽,内含小的脂质中心和少量泡沫细胞,纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织组成。

19周龄普通饮食组小鼠均有明显的脂质条纹块形成,其中泡沫细胞聚集,有少量纤维成分交联其中,其病理改变并非真正意义上的纤维斑块,或者可以称作纤维斑块形成的过度前期;而高脂饮食组小鼠均有斑块形成,斑块大小、面积与15周龄高脂饮食组相比有不同程度的进展,并均以胶原含量较多的纤维斑块为主。

24周龄普通饮食和高脂饮食组小鼠全部有斑块形成,普通饮食组的纤维斑块大小、程度类同于15周龄高脂饮食组的纤维斑块;24周龄高脂饮食组比19周龄高脂饮食组的斑块在面积、泡沫细胞堆积、胶原及弹力纤维沉积等方面程度重。

28周龄两种饮食组小鼠全部有斑块形成,普通饮食组的斑块1只有粥样斑块形成,其余4只的斑块在大小、程度上介于19周龄和24周龄高脂饮食组的斑块之间;高脂饮食组斑块与24周龄高脂饮食组相比,纤维帽变薄、泡沫细胞堆积、部分破裂。

36周龄普通饮食组全部形成粥样斑块,程度类似于28周龄高脂饮食组;36周龄高脂饮食组粥样斑块进展明显,大量泡沫细