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葡萄籽超微粉中原花青素含量的测定

葡萄籽原乳是由儿茶素、儿茶素和未经处理的无机酸酯组成的多聚体。4-c6或4-c8通过相同的价格连接而成。安全性高，易于去除自由基和氧化反应。原花青素测定常用的有铁盐催化比色法、紫外分光光度法、香草醛法、福林肖卡-HPLC结合法等方法。紫外分光光度法因其干扰性物质较多,只适用于原花青素纯度特别高的产品,不适合一般原料中原花青素的检测。香草醛法测定的是原花青素单体及其多聚体的总量,福林肖卡-HPLC结合法需要使用HPLC,过程较复杂。铁盐催化比色法操作简便,对原花青素测定专一性较好,本文针对此方法进行了研究,以期为制定统一的葡萄籽及其产品中原花青素检测方法提供参考。

1加热条件下合成c-c键断裂

通常选择正丁醇和盐酸为反应介质,以Fe3+金属离子为催化剂,在加热条件下,使原花青素单体与单体之间的C-C键断裂,形成中间产物,中间产物脱去C2位上的H,形成在550nm处有最大吸收峰的红色花青素。

2材料和方法

2.1微晶纤维素食品级

原花青素:化学标准品,天津尖峰天然产物开发公司;葡萄籽超微粉、花色苷:均为葡萄酒学院自制;微晶纤维素(食品级),芦丁:Sigma公司;甲醇、正丁醇、浓盐酸、硫酸铁铵、VC均为分析纯。

10%硫酸铁铵:称取10.0g硫酸铁铵,用2mol/LHCl溶解定容至100mL。

反应混合液:取正丁醇、浓盐酸、10%硫酸铁铵按体积比为83∶6∶1混合均匀。

2.2主要设备

UV-1700紫外-可见光分光光度计(岛津);恒温水浴锅;超声波振荡器;索氏提取器。

2.3方法

2.3.1标准系列使用液

称取原花青素标准品10.00mg,用甲醇溶解、定容至10mL,制得浓度为1.00mg/mL的标准液。再用甲醇稀释,制成浓度为0、10、25、50、100、150、200μg/mL的标准系列使用液。分别吸取使用液1.0mL于10mL刻度试管中,加入9.0mL反应混合液,塞紧塞子,摇匀,置于沸水浴中加热40min后,立即取出用冰水冷却4min~5min,取出,恢复至室温后(15min),在550nm处以试剂空白调零,测定吸光值A550,绘制吸光值—原花青素浓度的标准曲线。

2.3.2脂肪的提取

准确称取干燥后的葡萄籽超微粉样品0.5g,通过索氏提取法利用石油醚去除粗脂肪,然后置阴凉通风处挥尽样品中的石油醚。加甲醇150mL超声波振荡提取30min,2次,混合提取液得到样品溶液。根据原花青素的含量,用甲醇稀释至合适浓度,吸取1.0mL,按照2.3.1操作,测定吸光值并计算含量。

3结果与分析

3.1反应条件的确定

3.1.1光、半紫外光

原花青素在光照下不稳定,因此分别在完全避光、半避光(仅冷却过程中避光)、不避光条件下进行实验。结果A550无显著差异,说明光照对原花青素生成花青素的反应没有影响。

3.1.2研究最大吸收波长的确定

在400nm~700nm处对反应后的溶液进行扫描,得到花青素的典型吸收峰,最大吸收波长为550nm。

3.1.3硫酸铁铵添加量

在原花青素生成花青素的过程中,Fe3+应是起催化剂作用的。如图1显示,不添加硫酸铁铵,A550仅为0.1,添加后A550显著提高。硫酸铁铵在反应体系中含量1g/L~2g/L时,吸光值基本稳定,因此确定硫酸铁铵浓度为1g/L。

3.1.4反应时间对a50活性的影响

生成花青素的反应需要较高的温度,室温下反应极慢,在20℃下反应5d,A550仍低于0.1(原花青素浓度120μg/mL)。图2显示了在85℃、95℃、100℃温度下吸光值随反应时间的变化。随着反应温度的升高,反应速度不仅加快,而且花青素生成量提高。在100℃下,反应40min、50min、60min的A550无显著差异,因此选择100℃为反应温度,反应时间为40min。这一结果与傅武胜结果相同。

3.1.5盐酸溶液的含水量

花青素生成反应受酸度与含水量影响较大。图3显示,吸光值随着含水量的增加而降低。但是酸度越高,吸光值随含水量的增加而下降的幅度越小,这表明较高的酸度更能降低外来水分对反应体系的影响。这与判断合适的含水量为3%~4%或6%的结论有所不同。反应体系中盐酸浓度6.0%,0.5%~6%的含水量时,A550无显著差异。因此选择酸度6.0%,含水量1%较适宜。

3.1.6正交实验结果

通过单因素试验,选择合理的因素水平进行正交试验以确定最佳的检测条件(见表1)。对于体系含水量,选择在较小的水平,即1.0%,用来溶解硫酸铁铵。极差分析表明,各因素对反应体系的影响程度从高到低依次为BDCA,即温度影响最大,然后是盐酸含量、反应时间、最后是硫酸铁铵含量,且最佳检测组合为A3B3C