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动物体细胞克隆的研究进展

1加快提升scnt效率

细胞克隆技术也被称为细胞移植技术，是将动物细胞的细胞移植到准切合物品种或异质卵母细胞的骨髓中，重建胚胎并恢复细胞分裂，并继续发展为与所需细胞完全相同的后代。目前SCNT在畜牧业的许多领域中都有广泛的应用,如育种选择、转基因家畜生产、优质畜种扩繁,加快畜种育种进程,拯救濒危稀有保护品种等。1997年首例克隆动物多莉羊诞生以来,体细胞克隆技术就开始迅速发展,现已成功应用在小鼠、山羊、牛、猪、水牛、兔子、大鼠、马、白尾鹿、狗、雪貂、等哺乳动物上。随着SCNT研究的不断深入,越来越多的研究者开始了对SCNT效率改善的研究,包括在培养液中添加外来物质如左旋肉碱、丙戊酸或MG132等或使用不同类型的细胞;细胞提取物处理细胞;优化培养体系;确立融合参数等实验来提高克隆发育率以及通过表观遗传方式的改变包括重编程胚胎染色质组蛋白乙酰化水平的提升来提高SCNT效率。ES细胞现已应用在小鼠克隆研究中,尤其是用在连续克隆中,ES细胞克隆小鼠效率相对较高(最高可达33%),同时成功使得细胞周期同步化,使得卵质和表观遗传错误在体外培养的过程中得以避免。而克隆后代的发育与出生还受许多生物本身和技术的影响,在克隆家畜中卵母细胞质量、供体细胞和受体母畜都有不可避免的相当大的个体差异,因此对于家畜的克隆有更多的不确定性。虽然目前SCNT技术有诸多改进,但SCNT存在的总效率低下,胎盘肥大和表观遗传缺陷还是没有能够得到很好解决。

2现在，有一个关于克隆的问题

2.1iiif细胞内克隆

虽然体细胞克隆已成功克隆出许多动物,但克隆的效率却非常低下。Kishigami等指出即使是非常成功的核移植克隆动物后代的成活率也只有20%,而通常克隆成活率为0～2%,并且克隆生产出的动物常有多种异常或畸形。Loi等同时用SCNT和IVF生产绵羊的囊胚,结果发现体细胞克隆的囊胚率与体外受精囊胚率相近,同时移植相近数目的SCNT囊胚和IVF囊胚到受体母羊中,与移植的123枚IVF囊胚中有51枚(41.6%)发育成胎儿并健康出生相比,移植了93枚的SCNT囊胚在妊娠30天后只有12(13%)枚发育成胎儿并可以发展到足月,且所有SCNT的羊羔都存在疾病。张家新等通过不同融合电压和血清饥饿法处理细胞对体细胞克隆进行改进后其克隆效率从操作卵数算起也只有0.6%左右。Watanabe等对日本的克隆牛进行全国范围内调查显示,10年间体细胞克隆胚胎总数达3264,而出生的克隆牛只有301头,克隆效率为9.9%。牛克隆胚胎的移植成功率和SCNT生产的牛存活率与20年前相比没有提高(1998年移植的胚胎成功率为24.5%;而2007年为26.4%;1998年犊牛出生率为9.9%,而2007年为7.5%),且体细胞克隆胚胎最显著的特征是自然流产率非常高。Wakisaka等在研究中发现小鼠的克隆胚胎50%可以发育到囊胚阶段,但到达足月的仅有2%～3%。即使用ES细胞作为供体细胞,功率依然很低,大约是5%～8%。Kishigami等指出克隆的效率低下是基于克隆胚胎或胎儿发育过程中错误的累积;如在小鼠中不考虑供体细胞类型,大约有50%的重构胚胎可以发育成囊胚或桑葚胚,但是90%的克隆胚胎都会在5～8天发育受阻,且多是在移植后或器官形成前立即发生。

2.2体外受精胎层结构的变化

胎盘肥大几乎是体细胞克隆胚胎包括死亡胚胎特定的并发症。多数存活的克隆动物常出现过度生长称为“巨胎症”,尤其胎盘经常出现过大和功能不良的情况。Wakisaka等研究了小鼠异常胎盘的迷路层、海绵丝原细胞层(spongiotrophoblast,ST)、巨细胞层3个胎儿分隔的超微结构,结果显示体细胞克隆异常的胎盘保留着基本的区域模式,但存在明显的病理变化:第一,2个胎层的界限不规则地交错,这与体外受精胎盘的胎层有一个非常光滑的边缘形成了鲜明的对比。第二,糖原数目增加引起ST层增大,所有的ST层都是由大簇的糖原细胞组成,然而个别的糖原细胞在超微水平下没有显示出明显的病理学改变,在细胞质中这些糖原细胞有典型的适当的糖原沉积。相反的,ST层的另一个主要的细胞类型海绵丝细胞显示了各种超微结构的变化,这些变化中最普遍的特征包括载有同质电子的不透明材料的粗面内质网显著扩张,绕核的高尔基体数目增加。结果ST层的直径增加了2～3倍,这在体外受精组中最明显。Hill等研究了妊娠30～90天的克隆胚胎的胎儿和胎盘,发现了30天妊娠的克隆胚胎其妊娠率与体内胚胎相似(45%vs58%),而30～90天之间有82%的克隆胚胎死亡,而所有体内胚胎依然存活。克隆胚胎的胎盘有两种异常,一种胎盘扁平、立方绒毛膜上皮细胞减少,并伴有尿囊血管显著减少,在胎盘发育成形前胎儿就已经死亡;另一种胎盘绒毛膜上皮是正常的,但是子