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茯苓皮三抗氧化活性研究

椰子是多孔菌科的一种干燥菌核，也被称为松红薯和松岭。它最早出现在《神农本草经》中。具有润水利尿、健胃健脾、安神的功效。它被列为10种药物和9种椰子。现代医学研究表明,茯苓具有抗肿瘤、延缓衰老等生物活性,其主要活性成分为茯苓多糖、三萜类物质等化学成分。茯苓皮为茯苓菌核的外皮,有研究表明茯苓皮中的三萜类物质含量远高于茯苓菌核。然而,目前加工茯苓时,仅利用了茯苓内核(白茯苓)和茯神,茯苓外皮、加工白茯苓块时切割下的残块、粉末等皆被当成废料处理,造成了原料的极大浪费。

众所周知,自由基具有高度的氧化活性,攻击破坏细胞,疾病与衰老过程都与体内自由基过量有关,国内外对茯苓皮三萜类物质抗氧化活性的研究却鲜见报道。本实验以茯苓皮三萜类物质为研究对象,测定和分析茯苓皮三萜类物质的抗氧化活性,旨在为茯苓皮应用于高附加值保健食品加工提供参考,为其进一步研究及开发利用提供科学依据。

1材料和方法

1.1小鼠、家鸡、动物

茯苓,收集自湖北罗田九资河镇,由湖北省中医药研究院提供;昆明种小鼠,购于湖北疾控中心;家鸡,农户提供;熊果酸标准品(纯度99%)上海友思生物技术有限公司。

1.2仪器、仪器和仪器

EYELAN-1000型旋转蒸发仪日本东京理化器械株式会社;722型分光光度计上海欣茂仪器有限公司;UV-1700紫外扫描仪日本岛津公司;BPCL-型微弱发光测量仪中国科学院生物物理研究所;H-923型落地式高速冷冻离心机日本Kokusan公司。

1.3方法

1.3.1液的稀释和测定

准确称取过60目筛的茯苓皮粉10g,75℃条件下,300mL甲醇回流提取4h,提取液过滤后继续回收提取,重复2次,合并过滤液,经旋转蒸发减压浓缩定容至100mL,样品液再稀释100倍备用。根据文献中定性分析结果和含量测定,茯苓皮中三萜的含量为1.58%。以茯苓皮三萜甲醇液(1.58mg/mL)作为100%的初始液,再按比例递减稀释成80%(1.26mg/mL)、60%(0.95mg/mL)、40%(0.63mg/mL)、20%(0.32mg/mL)的溶液备用。

将茯苓皮三萜甲醇液用氯仿萃取,经减压浓缩后精确称取250mg,用甲醇重新溶解,定容于50mL容量瓶中,配成5mg/mL初始液,再分别稀释至3.75、2.5、1.25mg/mL的梯度递减溶液备用。

1.3.2量效关系方程

用邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-鲁米诺发光体系测定茯苓皮三萜提取物清除O2-·能力。用不同质量浓度茯苓皮三萜样品测定系统发光值,得抑制率,以抑制率为纵坐标,样品质量浓度为横坐标,绘出量效曲线,建立量效关系方程。以抑制率为50%时样品的质量浓度(IC50)值衡量样品对过氧化氢的清除能力。抑制率计算公式(参照文献,并略作修改)如下:

式中:CL空白对照为缓冲液的化学发光值;CL本底为添加化学发光剂和缓冲液的化学发光值;CL样品为添加不同质量浓度茯苓皮三萜样品的化学发光值。

1.3.3三叶窗椰子提取物的去除h活性物质

用邻菲啰琳-硫酸铜-抗坏血酸-双氧水发光体系测定茯苓皮三萜提取物清除·OH能力。根据式(1)计算抑制率。

1.3.4三尖提取物能去除p2o4的能力

采用H2O2-鲁米诺-碳酸缓冲液体系测定茯苓皮三萜提取物清除H2O2能力。根据式(1)计算抑制率。

1.3.5三叶草对红细胞氧化溶血的影响

抑制家鸡红细胞氧化溶血作用参照文献方法进行测定。以红细胞在对照组管中的溶血率为100%,计算茯苓皮三萜提取物红细胞溶血率。

1.3.6三叶草对肝脂质过氧化的影响

茯苓皮三萜提取物体外抑制肝脂质过氧化能力的测定参照文献方法进行。

式中:AMDAc为对照处理的吸光度;AMDAs为样品处理的吸光度。

2结果与分析

2.1熊苹果中的三甲醇液对清除o2-的作用

茯苓皮三萜提取物清除O2-·效果如图1所示,由式(1)计算得O2-·抑制率如图2所示。

由图2可知,茯苓皮三萜甲醇液与对照品熊果酸甲醇液都有一定清除O2-·的能力,随茯苓皮三萜质量浓度增大,对O2-·抑制率逐渐增强,表现出明显的剂量效应关系,在0.32~1.58mg/mL质量浓度范围内,当质量浓度达到1.58mg/mL时,其清除能力最高,其IC50值为1.01mg/mL。由图1可知,在10s内,熊果酸甲醇液发光值急剧下降,而茯苓皮三萜则呈现显著的上升趋势,质量浓度为0.95mg/mL和1.58mg/mL时最高发光值达10844和7476,说明茯苓皮三萜甲醇液对清除O2-·有明显的作用;随着反应进行,各处理发光值均有不同程度下降,添加茯苓皮三萜甲醇液体系化学发光值总体小于添加熊果酸甲醇液体系化学发光值,表明三萜类物质对清除O2-·效果理想,且持续时间长,优于熊果酸。

2.2质量浓度对制作用的影