固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素.docxVIP

固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素

环境中的雌激素是环境中的一种杂草。这是指从人类活动引起的环境中释放的有害化学物质。这些物质进入水体后，会扰乱水体的体内功能，通常被称为“外部内经功能障碍”。原料奶的质量是乳制品的根本,是保证奶制品食用安全、维护人类健康的基础。原料乳中是否存在雌激素至关重要,其中若残留激素,则对人体有一定的毒性。本研究对原料乳中5种雌激素进行了分析检测,其中既有内源性雌激素(雌酮、雌二醇和雌三醇)也有环境雌激素(己烯雌酚和双酚A),都属于人工合成或自然界存在的,它们可通过食物链或直接接触等多种途径进入体内,模拟动物体内内源性激素,具有协同或拮抗正常的内源性激素的作用,干扰内分泌功能,多被称为环境雌激素。近来,对牛乳中环境激素检测的研究较多,常用的方法有:气相色谱-质谱(GC-MS)法、高效液相色谱(HPLC)法、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、荧光分析法等。例如张红英等人的研究是在有机溶剂提取的基础上对样品进行衍生,然后采用气相色谱-质谱法检测原料乳,但是前处理过程复杂,并且接触大量的有毒试剂,需要长时间的衍生化过程。而本文用固相萃取替代衍生过程,优化了提取、净化、色谱测定等参数,成功建立了固相萃取、LC-MS测定原料乳中5种环境雌激素残留量的方法。不仅提高了分析样品的工作效率,还在优化前处理方法的基础上,取得了比较满意的结果。

1材料和方法

1.1仪器、药品和仪器

原料奶采自北京市11个不同的奶牛养殖场;雌三醇标准品纯度97.4%、雌二醇标准品纯度96.7%中国药品生物制品检定所;雌酮标准品纯度99.5%、双酚A标准品纯度98.5%德国Dr.Ehrenstorfer公司;己烯雌酚标准品纯度99.7%,中国计量科学研究院;甲醇HPLC级、乙腈LC/MS级美国Fisher公司;氮气、氩气(99.999%);超纯水美国Milli-Q纯水系统制;其他试剂均为市售国产分析纯试剂。

ACQUITYUltraPerformanceLCTM超高效液相色谱仪、QuattroPremierMicromass质谱仪、MassLynx数据处理系统美国Waters公司;KQ-500DE医用数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;Sigma2K-15高速冷冻离心机博劢行仪器有限公司;CleanertNH2-SPE固相萃取柱500mg/3mL美国Agela公司;旋转蒸发仪RE-52A上海振捷实验设备有限公司;SHB-Ⅲ型水循环真空泵郑州市上街区仪器厂。

1.2lcms条件

1.2.1流动相、回收相

色谱柱:ACQUITYUPLCTMHSST3(2.1×50mm,1.8μm);流动相:乙腈-甲醇(4∶1,A)与0.01%氨水(B),流速0.3mL/min,梯度洗脱程序见表1;柱温35℃;样品室温度25℃;进样量为10μL。

1.2.2去溶剂气温度

电喷雾离子源;负离子扫描模式;毛细管电压2.37kV;离子源温度120℃;去溶剂气温度450℃;去溶剂气流量800L/h;锥孔气流量50L/h;碰撞气体为氩气,碰撞气流速度为0.14mL/min,多反应检测(MRM)模式检测。

1.3质谱条件的优化

分别称取标准品10.0mg于10mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀释定容,得到质量浓度为1.0g/L的单标准储备溶液,于-20℃冰箱保存备用。分别取上述储备液用乙腈-水(1∶1,v/v)或乙腈-0.01%氨水(1∶1,v/v)稀释为1mg/L的标准溶液用来优化质谱条件。

各取单标准储备液适量,用初始流动相做稀释液配制所需浓度的混合标准溶液。

1.4流出物的提取

量取2mL原料奶样品于15mL离心管中,加入10mL乙腈,漩涡混匀1min,于25℃超声25min,在4℃下以12000r/min离心10min,移取上清液,待上清液恢复至室温后过NH2柱。在NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠(经650℃烘烤4h,保存在干燥器内,冷却后备用),下接旋转瓶放在固定架上。加样前先用4mL乙腈-甲苯(3∶1)预洗柱,当液面到达硫酸钠的顶部时,迅速将上清液转移到净化柱上,再用25mL乙腈-甲苯(3∶1)洗涤柱子,收集所有流出物于旋转瓶中并在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干。用1mL乙腈/甲醇4∶1-0.01%氨水(2∶3,v/v)溶液溶解残渣,经0.22μm滤膜过滤,移入1.5mL自动进样器样品瓶中,供HPLC-MS/MS测定。

2结果与讨论

2.1样品处理方法的选择

2.1.1牛乳中脂质量分数的提取

这5种环境雌激素都属于疏水性有机化合物,易溶于大多数有机溶剂。本实验采用超声提取方式对样品进行提取,先后比较了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4种溶剂的提取效果,得到5种环境雌激素