牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法.docxVIP

SN/T3495—2013

牛及其产品中转基因成分实时荧光

PCR检测方法

1范围

本标准规定了牛及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR检测方法。

本标准适用于转人乳铁蛋白基因奶牛、转人a乳清白蛋白基因奶牛、转人溶菌酶基因奶牛及肉制品、奶制品等转基因成分实时荧光PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

92m:P2微球蛋白(P2-microglobulin),

bp:碱基对(basepair)。

CMV;巨细胞病毒(eytomegalovirus)

Cr;每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(cyelethreshold)。

dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinettiphosphste)。

dCTP?脱氧胞苷三磷酸(deoxyeyticinetriphosphate)。

dGTP?脱氧鸟苷三磷酸(dcoxyguanosinetriphosphate),

dTTP?脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)。

dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)。

DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleieacid)。

GFP:绿色荧光蛋自(GreenFluorescentProtein)。

hLA:人乳清蛋白(huamanlactobumin)。

hLF;人乳铁蛋自(huamanlactoferrin)。

hLY;人溶菌酶(huamanlysoeyme)。

NPTⅡ;新霉素-3磷酸转移酶基因(neomycin-3-phosphotransferasegene)。

SV40;薇猴空泡病毒40(SimianVacuolatingvirus40)。

PCR?聚合酶链反应(polymerase

chain

reaction)。

Tag酶：聚合酶(DNA)。

TE:TrisHel,EDTA缓冲液。

Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)。

2

SN/T3495—2013

4实验方法

4.1主要仪器

4.1.1实时荧光定量PCR仪。

4.1.2超净工作台。

4.1.3核酸蛋白分析仪。

4.1.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。

4.2主要试剂

除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。

4.2.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规定。

4.2.2PCR缓冲液。

4.2.3氯化镁(MgCl)。

4.2.4dNTPs(dATP,dTTP,dCTP.dGTP)。

4.2.5Tag酶。

4.2.6其他药品及试剂配制方法见附录A。

4.3引物和探针

按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，加入无离子水配成100pmol/pl.贮存，配成

直接用于PCR反应的10pmol/pL.的工作液。

表1检测转基因动物内外基因所需的引物序列

被检测基因

基因来源

引物序列

探针序列

备注

牛β2m

内源

5-CTGCTATGTGTATGGGGTTCC-3S°-GTAGAAAGACCAGTCCTTGC-3

5*-AGACAGGTCTGACTGCTCC

GATTTAATC-3

内对照

NPTⅡ

外源

5*-TATGACTGGGCACAACAGAC-3°5*-CGTCTTGCAGTTCATTCAGG-3

5-CTGCTCTGATGCCGCCGTGTTC°3

筛查检测

CMV

外源

BGTTCCGCGTTACATAACTTACGG-35*-AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG-8

S-CCGCCTGGCTGACCGCCCA

AC-3”

筛查检测

GFP

外源

5*=AACCAATCGAGCTGA