用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型鸭流感病毒.doc

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用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测

H5亚型鸭流感病毒

【摘要】：鸭流感的暴发和流行给畜牧业造成了巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。本研究建立一种新型、简便、灵敏且特异的环介导等温扩增技术（Loop-mediatedIsothermalAmplificationMethod，RT-LAMP）用于H5亚型鸭流感病毒的检测。根据Genbank中注册的H5N1亚型鸭流感病毒HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件，等温扩增反应条件为65℃保温60min。反应结果肉眼可见。在扩增产物加入焦磷酸离子和溶液中镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀，可见反应管中浊度的变化；或者在扩增后产物加入核酸染色剂SYBRgreenⅠ，检测结果阳性呈绿色，阴性为橙黄色；同时用特异性内切酶KpnⅠ进行酶切鉴定。用已建立的RT－LAMP技术检测临床样品，检测结果与RT－PCR方法符合率均达到100％。RT-LAMP技术整个检测过程只需1－2h，不需要贵重的PCR仪和成像系统，仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立RT-LAMP技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测H5亚型鸭流感病毒的技术，适合于检验设备简陋的生产厂场、基层检验检疫单位和防疫部门使用。

【关键词】：H5亚型鸭流感病毒HART-LAMP

【正文】

鸭流感是由禽流感病毒引起的一种烈性传染病,鸭流感不仅严重影响养鸭业的发展,而且会影响人类健康。建立快速，敏感，特异的检测鸭流感病毒的方法对于防控鸭流感有着重要意义。

NotomiT等(2000)开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(LAMP)。其特点是针对靶基因的6个区域,设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温(65℃左右)中反应1h，即可完成核酸扩增反应，反应结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪,可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控(Manmohanetal，2004；Yasuyoshietal，2004；Dukesetal，2006)。也有研究者通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果（Dukesetal，2006)。而不需模板热变性(Nagamineetal，2001)、长时间温度循环、凝胶电泳、紫外观察等过程。目前，国外已有较多的此类报道，并建立了专门的官方网站。而国内起步较晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引进LAMP法检测胚胎的性别(王海浪等，2003)。国内外有许多文献报道该技术在不同细菌（Hungetal，2005）及病毒检测中成功应用的实例，如对西尼罗病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山药嵌纹病毒的检测以及登革病毒的分型等（Hongetal，2004；Manmohanetal，2004；Shiroetal，2004；Manmohanetal，2005；Motokoetal,2005；J.P.Dukesetal，2006）。同时，人们还在不断对LAMP技术进行改良，使其能在疾病基因诊断、食品分析(曾冰冰等，2007)和环境监测等领域更好地发挥作用。国内还未见用于流感病毒的检测。国外有报道用RT－LAMP技术检测人流感H1、H2和H3亚型流感病毒（Leoetal，2005），还用于鉴定流感A、B型的诊断（Masahiroetal，2006）。LAMP法具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点：（1）只需一恒定温度就能扩增反应。不需要预先进行双链DNA的变性。（2）高特异性:应用六个区段，四条引物，并且这六个区段的顺序也有规定。原理上LAMP法扩增的特异性很高，因此可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否,即能够进行细菌或病毒的定性检测。（3）快速、高效扩增:整个扩增在不到1h即可完成，且产率可达到0.15mg/ml。为提高LAMP反应的速度，Nagamine等（2002）通过2条环状引物加快LAMP的反应，使反应时间比原来缩短近一半，提高了检测效率。（4）灵敏度高：扩增模板可达10拷贝。（5）步骤简单：扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，就能够完全像DNA基因扩增那样，一步实现RNA扩增（Hirokoetal，2006；H.Solimanetal，2006；Kazuyaetal，2007），反应不需PCR仪和特殊试剂。（6）鉴定简便：在