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乳酸菌LPxTG结构蛋白共表达乳源抗氧化肽的体系构建与特性

研究

摘要

多数乳杆菌表面拥有一种含LPxTG基序的表面蛋白，这种蛋白被认为具有黏附和

胃肠耐受功能。由于LPxTG的基序可以与乳杆菌表面的SortaseA(SrtA)相互作用，这

种特殊的作用在多种生物技术应用中具有很大的潜力。蛋白质水解产生的生物活性肽具

有多种生理和功能活性。乳制品中含有大量功能性肽，如抗氧化肽等，这些功能性肽在

功能食品领域具有很大的潜力。衰老和疾病的一个重要特征是氧化还原的不平衡。因此，

在饮食计划中加入一些食源性抗氧化肽对健康有益。然而，由于胃肠道环境和低吸收效

率，口服抗氧化肽往往受到限制。在本研究中，通过将C-端疏水结构域和带正电荷的尾

部替换为含有N端甘氨酸的合成抗氧化肽，设计了一种名为LPxT-GYLEQ的多功能蛋

白。研究发现，LPxT-GYLEQ蛋白与罗伊氏乳杆菌（Limmosilactobacillusreuteri）共培

养后表现出更好的抗氧化活性稳定性，这一结论在HO诱导的HepG2细胞氧化损伤模

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型中也得到验证。同时，本研究中通过体外胃肠耐受实验验证了LPxT-GYLEQ蛋白对

人工胃液和人工肠液具有一定的耐受能力。进一步的实验结果也证明，该合成蛋白在肠

细胞模型上具有良好的黏附性能。此外，本研究在D-gal(D-半乳糖)诱导的衰老小鼠模型

中证实了LPxT-GYLEQ蛋白的体内抗氧化作用，并显示出其缓解衰老小鼠的认知和记

忆功能下降的效果。含有LPxTG基序结构并具有抗氧化，胃肠耐受以及黏附作用的多

功能蛋白的新策略设计，为抗氧化肽在宿主的口服递送方式上提供了新的思路。主要研

究结果如下：

1.LPxTG蛋白与抗氧化肽（GYLEQ）共表达体系的构建：提取罗伊氏乳杆菌SH23

的DNA，并设计引物进行PCR扩增，然后创新性的将抗氧化肽（GYLEQ）的基因序列

作为引物的一部分再次进行PCR，给目的基因上加上同源臂的同时将LPxTG蛋白与抗

氧化肽(GYLEQ)相连接，再构建重组质粒，顺利导入到感受态细胞中成功构建重组菌株

E-LPxT-GYLEQ。用IPTG诱导重组菌株-LPxT-GYLEQ进行蛋白表达，并通过亲和层析

法得到目的蛋白PxT-GYLEQ，分子量接近35kDa，与预测位置一致。

2.LPxT-GYLEQ蛋白的功能分析：在最佳共培养的条件下（即共培养时间为12h，

罗伊氏乳杆菌占总体积的1/12），LPxT-GYLEQ蛋白与罗伊氏乳杆菌表面的分选酶A可

以通过相互作用来释放出抗氧化肽GYLEQ。通过HO诱导HepG2细胞产生氧化应激，

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在此细胞模型下，使用LPxT-GYLEQ蛋白进行干预并测定干预后的细胞的存活率和

MDA含量、以及抗氧化酶CAT和SOD的活性等指标发现低剂量的LPxT-GYLEQ蛋白

能够显著缓解HepG2细胞的氧化应激状态。借助人工模拟胃肠液环境下对LPxT-

GYLEQ蛋白的胃肠耐受能力进行了分析，发现LPxT-GYLEQ在胃肠液处理后对自由基

仍具有较好的清除效果。此外，通过Caco-2细胞模型进一步验证了LPxT-GYLEQ蛋

白在低剂量下能够促进罗伊氏乳杆菌对肠道上皮细胞黏附作用，为抗氧化肽（GYLEQ）

在肠道中的持续释放提供理论依据。

3.LPxT-GYLEQ蛋白能够缓解衰老小鼠的氧化应激和炎症状态，改善衰老小鼠的认

知障碍。采用D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老小鼠模型来研究LPxT-GYLEQ蛋白的体内

抗氧化效果，并进一步评估LPxT-GYLEQ蛋白对肠道菌群的调节作用。结果表明，LPxT-

GYLEQ蛋白干预可以降低ROS，Aβ的水平，减少炎症因子IL-6和TNF-α的表达，增

加Nrf2，IL-10的分泌来阻断JNK/SAPK、p38MAPK、NF-κB等炎症信号通路的磷酸

化。此外，LPxT-GYLEQ蛋白干预后小鼠菌群的相对