免疫标记技术课件.pptVIP

免疫標記技術; 標記抗體技術是在抗體球蛋白分子上，連接某一個特定的、容易檢測的分子或原子(標記物)，利用標記抗體能與相應抗原結合的特性，通過標記物的檢測，從而確定抗原的存在部位。標記抗體技術目前廣泛應用的主要有螢光抗體、酶標記抗體和同位素標記抗體等。前二者主要用於抗原定位，而後者不僅可用於定性、定量，還可用於定位。此外尚有鐵蛋白標記抗體，主要用於免疫電鏡的技術，在亞細胞水準上進行抗原定位。;一、螢光抗體技術(Fluorescentantibodytechnique)

將螢光染料連接在提純的抗體球蛋白分子上，這種用螢光染料標記的抗體，就叫螢光抗體。一種物質受到短波光線(如紫外線、藍紫光)激發後，能放出波長比激發光長的可見光，此種光稱為螢光染料，抗體經過螢光染料標記後，並不影響其與抗原結合的能力和特異性。因此，當螢光抗體與相應的抗原結合時，就形成帶有螢光性的抗原抗體複合物，從而可在螢光顯微鏡下檢出。;;(一)直接法將提純的抗體球蛋白(主要為IgG)與FITC結合製成螢光抗體。;炭疽桿菌24h培養物直接螢光抗體檢測;1、製片：

待檢病理組織做成冰凍切片或觸片，細菌材料可做成塗片，在室溫中自然乾燥，病毒抗原通常用冷丙酮固定l5min，細菌抗原則用加熱固定即可。; 2、染色：

滴加螢光抗體，置37℃染色30～60min，用磷酸緩衝鹽水(PBS)充分洗滌以除去未結合的螢光抗體，加pH9.0緩衝甘油1滴，用蓋玻片封固。

3、鏡檢：

在螢光顯微鏡下進行檢查，抗原所在部位呈黃綠色螢光。;4、設對照：

進行直接螢光染色時，應設以下對照：

（1）用螢光抗體染正常組織切片或觸片應無熒塗片；

（2）將待檢材料先用未標記的抗血清處理，再用螢光抗體染色應不出現螢光。;(二)間接法先備制螢光標記的抗抗體（第二抗體），然後將提純的羊抗豬抗體用螢光素標記，即成羊抗豬螢光抗體。;1、製片：同直接法;2、染色：染色時，標本先滴加抗血清，在37℃處理30～60min；

用PBS充分洗滌後，再用螢光標記的抗抗體染色，37℃30～60min，洗滌，封固。;3、鏡檢：

抗抗體必須與抗血清是相應的，如該抗血清是豬??的，則用羊抗豬螢光抗體。

4、對照：

需用正常血清處理作為對照，此對照片應無螢光。;;免疫組化法：

用酶代替螢光素標識抗體作生物組織中抗原的鑒定和定位，稱為免疫組化法。

酶聯免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosorbentassay)簡稱ELISA：

用於可溶性抗原或抗體的定量，是一種既特異又敏感的方法。; 用於標記的酶有辣根過氧化物酶（HRP）、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶和B-半乳糖苷酶等。其中以HRP應用最廣。

HRP的作用底物為過氧化氫，催化時需要供氫體，無色的供氫體氧化後生成有色產物，從而使不可見的抗原抗體反應轉化為可見的呈色反應。; 酶抗體染色法和螢光抗體染色一樣，主要有直接法、間接法兩種。直接法系用酶標記抗體直接染色，間接法則先用抗血清處理，再用酶標記的抗抗體染色。;;; 酶標記抗體染色通常用冰凍切片，亦可用石蠟切片，用PBS洗淨，用直接法或間接法染色，洗去酶標識抗體後，滴加基質反應液顯色。常用的反應液為3，3`-二氨基聯苯胺(3，3，-diaminobenzlden，簡稱DAB)溶液(0.05%於pH2.6Tris鹽酸緩衝液中，臨用時加入0.02毫升l%H2O2)，洗淨後即可在光學顯微鏡下觀察。抗原所在部位呈黃褐。; 如又用蘇木精-伊紅對比染色，則細胞核呈紫色，與黃褐色的抗原對此明顯，效果較好。本法與螢光抗體技術相比，它不需要特殊的螢光顯微鏡，且形態結構看得清楚，定位比較精確。酶標片子可長期保存，有利於對結果作反復對比，不象螢光抗體片子只能短時間保存。由於酶促反應的產物能產生電子密度的改變，這樣就可進一步用電鏡作亞細胞結構的定位觀察，從而將光學顯微水準和電子顯微水準銜接起來。;; 其基本過程是將抗原或抗體吸附於固相載體，在載體上進行免疫酶試驗，底物顯色後，用肉眼或分光光度計判定結果，其 過程 如下。;

包被抗原（抗體）洗滌

底物顯色洗滌抗體（抗原）;1.抗原(或抗體)包被：

包被的蛋白質濃度通常為1～10ug/ml，應通過實驗選擇，最適濃度按所需濃度溶於包被液(PH9.6，0.05molNa2CO3緩衝液)加入聚苯乙烯滴定板的平底小孔內，4℃過夜，用含助溶劑吐溫20(0.05%)的PBS洗滌3次。

;2.吸附：

先加入與包被抗體(或抗原)相對應