三角帆蚌精氨酸酶基因的cDNA克隆与组织表达分析.pdfVIP

第35卷 第4期 水 生 生 物 学 报 Vo1．35，NO．4 2011年 7月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA July， 20l1 D0I：10．3724／SP．J．1035．20l1．00596 三角帆蚌精氨酸酶基因的eDNA克隆与组织表达分析 刘巧林 许宝红 肖调义 刘 敏 钟 蕾 苏建明2 (1．湖南农业大学动物科学技术学院， 长沙 410128；2．湖南农业大学动物医学院，长沙 410128) 摘要：精氨酸酶(Arginase，Arg)是生物体尿素循环当中一种标志性的酶类，它不但与生物体许多疾病相关， 而且是 目前用于治疗肿瘤和癌症的一种重要的工具酶。根据三角帆蚌消减杂交 eDNA文库获得的EST序列， 运用eDNA末端快速扩增(RapidamplificationofeDNAends，kACE)技术获得三角帆蚌精氨酸酶基因的全长 eDNA序列 。生物信息学方法分析表明精氨酸酶基因eDNA序列长 1720bp，开放阅读框(65— 1072)1008bp， 编码 335个氨基酸，5端非编码区为64bp，3端非编码区为648bp，软件推测其编码蛋白相对分子量为36．81kD。 研究采用实时荧光定量 PcR(quantitativereal—timePCR，qPCR)方法分析该基因在不同组织 中的表达规律， 结果表明，该基 因在肝脏 、胃、肠、鳃、心脏 、外套膜、斧足共 7个组织 中都有表达，但主要集中在肝脏、 胃和肠消化器官中表达。这可能说明低等的无脊椎动物三角帆蚌的精氨酸酶兼具有 I型和 Ⅱ型精氨酸酶的 特征和功能，既可以参与尿素循环，又可以在生理和病理过程中发挥重要作用，但还需进一步验证。 关键词：三角帆蚌；精氨酸酶；RACE；实时荧光定量 PCR；组织表达 中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1000—3207(2011)04．0596．08 精氨酸酶，又叫做 L．精氨酸尿素水解酶，其分 用_l，而且对急性非淋巴白血病细胞生长具有抑制 布广泛，在细菌、酵母、植物、动物中都存在。精 作用 ]。此外，Vanessa，eta1．[研究表明，用细菌感 氨酸酶被认为是尿素循环中的标志性酶，因为在尿 染虹鳟后，Ⅱ型精氨酸酶的表达明显上调 ，从而推 素循环中，几乎所有生物都是利用其他四种酶来合 断 Ⅱ型精氨酸酶可能具有抗菌作用。本文以肖调义 成精氨酸，而只有含有精氨酸酶的生物才能完成整 等_1]构建的三角帆蚌肝脏消减文库为基础，旨在克 个的尿素循环。精氨酸酶不但能将精氨酸水解为鸟 隆三角帆蚌精氨酸酶基因的 eDNA全长，研究精氨 氨酸和尿素，起到对体内氨解毒的重要作用 1【I2]，而 酸酶的组织分布情况，为后续精氨酸酶在三角帆蚌 且能进一步将鸟氨酸分解为精胺、亚精胺、腐胺等 体 内的功能研究及三角帆蚌抗病新品系的培育奠定 多胺及脯氨酸等 。研究表明多胺是细胞增殖和分化 基础 。 的必需成分，在促进细胞增殖 中发挥重要作用[3I4]， 脯氨酸则能促进胶原蛋 白的生成和伤口的愈合 5【I6]。 1 材料与方法 如果某种生物缺乏精氨酸酶时，就会产生一系列的 1．1 实验动物及处理 精氨酸酶缺陷症，如发育不 良，神经系统缺陷等J[卜。 二年龄健康三角帆蚌购 自湖南省常德市三角帆 精氨酸酶通过催化水解精氨酸，对肿瘤细胞进行营 蚌养殖基地，吊养于湖南农业大学水产养殖基地。确 养剥夺，且对正常组织影响较小，因此被认为是一 定健康蚌的标准是两壳紧闭，缩足迅速，出水管喷 种良好的抗肿瘤药物。许多实验证 明精氨酸酶能显 水力强，体色发白，体质健壮。取健康三角帆蚌置水 著抑制肿瘤细胞的分裂 l【刚，精