RNA干扰介导的FAS基因沉默抑制小鼠结肠癌细胞免疫逃逸的研究.pdfVIP

基础研究 Jichuyanjiu 《中国医学创新》第9卷第35期(总第245期)2012年12Jq RNA干扰介导的FAS基因沉默抑制小鼠 结肠癌细胞免疫逃逸的研究水 刘丹① 汪涯雅① 黄振倩① 【摘要 】 目的：探讨Rna干扰介导FAS基因沉默对小鼠结肠癌细胞免疫逃逸的抑制作用。方法：设计针对Balb／c小鼠Fas编码基因的 dsRNA分子，构建分子表达载体，采用脂质体法转染Balb／c小 鼠脾淋巴细胞。设置实验组 (转染 目标质粒)，阴性对照组 (转染空载体质 粒)及空白对照组 (未转染)，建立稳定表达克隆。采用流式细胞仪检测各组淋巴细胞FASF／ASL表达水平。通过同种异体混合淋巴细胞肿 瘤细胞培养实验 (AMLTC)，采用MTT(二苯基四氮唑溴盐)法观察 CT26细胞对稳定表达克隆淋巴细胞的诱导凋亡作用。结果：转染分子 载体后实验组淋巴细胞膜 FAS抗原表达水平明显下降，与阴性对照组及空白对照组对 比存在统计学差异。同种异体混合淋巴细胞培养实验 (AMLTC)证实与CT26共培养的实验组淋巴细胞凋亡减少，与对照组比较存在显著性差异。结论：RNA干扰介导的FAS基因沉默可有效封 闭淋巴细胞表面FAS抗原表达，减少肿瘤细胞通过FAS／FASL途径诱导抗肿瘤淋巴细胞凋亡的发生，从而增强宿主抗肿瘤免疫效应 ，抑制肿 瘤细胞增殖转移。 【关键词 】RNA干扰； 结肠癌； FASF／ASL doi：10．39696．issn．1674—4985．2012．35．007 结肠癌是常见恶性肿瘤之一，晚期结肠癌预后差， 亡作用及其在抗肿瘤免疫中的意义。 DukesC期的5年生存率只有 30％～60％，而DuckesD期的5 1 材料与方法 年生存率更低至5％，重要原因在于肿瘤生长早期即可通过 1．1 细胞培养 Babc／小鼠脾淋巴细胞株及小鼠结肠癌细胞 局部浸润、侵袭淋巴管或毛细血管等方式向远处播散转移 ， 株 (CT26)由暨南大学李伟教授惠赠。细胞株置于含 10％ 肿瘤的免疫逃逸造成机体免疫系统无法正确识别、清除播散 BSA，100u／ml青霉素，100txg／ml链霉素的RMPI1640培养 的肿瘤细胞，癌细胞聚集生长并诱导毛细血管增生，最终在 液中，于5％CO，37℃环境下培养。 肝脏、肺、前列腺及骨等脏器发展形成转移灶。研究证明机 1．2 分子载体构建 根 据NCBIGenBank中小鼠Fas基 因 体内存在着完善的抗肿瘤免疫监视系统和抗肿瘤免疫应答。 cDNA序列 (序列号：NM_007987，按照siRNA序列设计原 与此同时，肿瘤细胞也进化出了一系列机制逃避宿主的免疫 则，利用Ambion公司设计软件，选择2个靶位点设 计两对 监视和攻击 ，如共刺激分子表达缺陷，分泌可溶性免疫抑制 共四条60bp左右大小的DNA片段，靶位点为716bp一736bp 物质等，这就是肿瘤细胞的免疫逃逸。FAS(APO一1／CD95) 和782bp一802bp，序列如下：第一对正链 ：5’一GATCCATAC 与FASL(Fasligand)属于肿瘤坏死因子 (TNF)超家族 ，为 ATCCCGAGAATTGCrITITCAAGAGAAGCAAITCTCGGGATGTAT 细胞凋亡相关基因，其相互作用可诱导细胞凋亡 (Apoptosis)， 1]T【rITI-GGAAA一3’；负链：5’一AGC CCAAAAAAATACAT 从而维持机体发育和自身稳定所必需的细胞生理性死亡。该 CCCGAGAATrGCTTCTCTrGAAAGCAATTCTCGGGATGTATG一 系统同时也是机体抗肿瘤免疫的重要组成部分。FAS抗原高 3’。第二对正链 ：5’一GATCCGCATCAAGGAGGGCAAGATAq~F 表达于机体正常细胞表面，常见肿瘤如消化道肿瘤、肺癌、 cAAGAGATATCITGCCCTccTrGATGTrr兀TGGAAA一3’；负 乳腺癌 ，均表现为低表达FAS抗原，而高表达FASL抗原。 链：5’一AGCTrITCCAAAAAACATCAAGGAGGGCAAGATAT Greenehch等 ¨1和Wajant等嘲研究证实肿瘤细胞借助过表达 CTCTYGAATATc1TrGCCCTCCTTGATGcG一3’。由上海恒新公 的FasL，通过Fas／FasL途径诱导抗