E2F-1真核表达载体的构建和Genectin抗性细胞的筛选.pdfVIP

山东医药2010年第 50卷第 48期 E2F一1真核表达载体 的构建和 Genectin 抗性细胞的筛选 王长青 ，尹永硕 ，李 雷。，谢玉波。，肖 强 (1深圳市宝安人民医院，广 东深圳 518101；2东莞市人民医院； 3广西医科大学附属第一医院) 摘要：目的 通过构建含 E2F一1基因的真核表达载体，转染 胃癌细胞MGC一803，获得Genectin抗性的稳定过表 达 E2F一1的胃癌细胞株 。方法 PCR扩增 E2F一1基 因片段 ，经限制性 内切酶 EcoRI和 Hindm双酶切后将 E2F一1 定向克隆到真核表达载体 pCMV—HA2中转化筛选。用脂质体 Lipofectamine2000将该载体转染 MGC一803胃癌细 胞 ，然后用含 G418的培养基筛选获得具 Genectin抗性的过表达 E2F一1的胃癌细胞株 。RT—PCR和 Westernblot技 术检测MGC一803／E2F—l细胞内E2F一1表达情况。结果 重组载体pCMV—E2F一1一HA2经 EcoRI和HindllI双酶切 后得到预期片段，测序结果与报道的E2F一1基因完全一致。获取具 Genectin抗性的细胞克隆，并进行了扩增。RT- PCR和Westernblot证实重组载体 pCMV—E2F一1一HA2成功转入 胃癌细胞 内，并稳定过表达 E2F一1。结论 成功获取 具Geneetin抗性的稳定过表达 E2F一1的胃癌细胞株，为下一步的功能实验奠定了基础。 关键词 ：E2F一1；胃肿瘤 ；MGC一803细胞 ；转染 中图分类号：R735．2：R73—35 文献标志码：A 文章编号 ：1002—266X(2010)48-0019-03 ConstructionofE2F一1geneeukaryoticexpressionvectorandselection OfGenectin-resistantgastriccarcinomacells WANG Chang—qingl YINYong—shuo，LILei，xIEYu—Bo，XIAOQiang ， (1ShenzhenBao’anPeople’SHospitaf．Shenzhen518101，P．R．China) Abstract：0bjective ToconstructaneukaryoticexpressionvectorcontainingE2F一1geneandtransfectthevectorin— togastriccancercelllineMGC一803．M ethods TotalRNA wasextracted from normalhuman liver．E2F一1cDNA was clonedbyusingRT—PCR methodandtransferredintoeukaryoticexpressionvectorpCMV-·HA2 afterdigestedbyrestrictive endonucleaseenzymeHind m andEcoR I．ThenpCMV—E2F一1一HA2wastransfected intoMGC一803cellswithLipo— feetamine2000．Thegenectin—resistantcellswereselectedandharvestedinmedium containingG418．RT—PCR andW est— ern blotwereusedto identifytheexpressionofE2F—1．Results pCMV—E2F—l—HA2 prospectivefragmentswasobtained andtheresultofsequencingwascompletelyconsistentwiththereportedE2F一1genesequences．Cellcloneswithresistance toGenetecinwereobtainedandamplified．ExperimentalresultsofRT—PCR andW estern blotconfirmedthattherecombi— nantvectorpCMV—E2F一1一HA2wassuccessfullytransfectedintogastriccancercelllineMGC一803and