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进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素（A、B、C、D）、大肠埃希氏菌O157细胞毒素等多种细菌毒素的快速检测方法编制说明
一、工作简况
1 任务来源
本项目由国家认证认可监督委员会2010年下达给海南出入境检验检疫局，标准名称为《进出口食品中金黄色葡萄球菌肠毒素（A、B、C、D）、大肠埃希氏菌O157细胞毒素等多种细菌毒素的快速检测方法》，专业类别为食品检疫，计划编号2010B143。
2 起草单位
中华人民共和国海南出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。
3 主要工作过程
在本标准的制定中，主要工作过程为：查找资料，购买金黄色葡萄球菌肠毒素（A、B、C、D）、大肠埃希氏菌O157细胞毒素的单克隆抗体，购买液相芯片微球及生化试剂，利用购买的单抗和微球，进行微球与单抗偶联，优化反应条件，建立液相芯片检测方法。并在云南局、新疆局相关实验室进行了测试，效果良好。参照实验研究成果，编写了本标准。
4 主要起草人及其所做的工作
李丹丹 全面负责本标准中检测方法的建立 徐义刚 细菌分离 季新成 细菌分离、鉴定 艾军 液相芯片检测方法建立 卓海华 检测方法建立 王丹云 检测方法验证 吴山楠 标准编写 黄纪徽 标准编写
二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据
2．1 标准的编写是按GB/T1.1进行的。
2．2 提出本标准的依据
金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、肠出血性大肠埃希氏菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是一种普遍存在于自然界中重要的食源性致病菌。由二者产生的多种肠毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）引起的食物中毒是个世界性卫生问题。食物中带有的金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌主要是由原料带入或在生产、 包装和烹调过程中污染，在适当的贮存环境下繁殖并产生毒素，而造成食物中毒。因此，在进出口食品中检验金黄色葡萄球菌肠毒素（A、B、C、D）、大肠埃希氏菌O157细胞毒素等多种细菌毒素是非常重要的。
细菌毒素现行的实验室诊断技术包括细菌分离鉴定、间接免疫荧光和PCR和基因序列分析等抗原检测方法。单纯检测病原菌的存在与否并不能完全保障食品中没有细菌毒素的残留，因此，必须一次性高效的检出真正致病作用的多种细菌毒素因子才能从根本解决食品的安全性问题。由于传统方法检测肠毒素比较繁琐，效率低；蛋白芯片法是近年来新发展起来的一种快速检测方法，它是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上，利用荧光或酶显色进行检测，并通过电脑程序分析从而得出准确结果。蛋白芯片法具有快速、高效、高通量信息处理等优点，被广泛应用于多种微生物的检验，是替代传统方法最具远景的检测技术，所以制定“采用蛋白芯片法建立食品中金黄色葡萄球菌肠毒素（A、B、C、D）、大肠埃希氏菌O157细胞毒素等多种细菌毒素的快速检测方法”的行业标准对进出口食品的快速通关非常必要。
三、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果
3. 1 在本标准制定的过程中，课题组主要进行了以下工作：
（1）购买金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D 单抗，以及出血性大肠埃氏菌O157细胞毒素的单抗。SEA(货号 HO408),SEB(货号 A0810),SEC(货号 H3007),AntiE coli(货号 35-460)，以上试剂购于 Santa Cruz Biotechnology公司；SED(货号 BM1327)，购于Acris公司；含金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D的菌株购于菌种保存中心。
（2）购买生物素标记羊抗鼠二抗。
（3）购买五种不同编码微球，建立单一微球和单抗偶联的液相芯片检测方法。五种不同编码微球购于QIAGEN公司。
（4）优化条件，建立五种微球与单抗偶联的试验，建立检测方法。
（5）运用液相芯片的方法对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D和出血性大肠埃氏菌O157细胞毒素进行混合检测，对其抗原进行1:10、1:20、1:30、1:40、1:50倍稀释，均可检测出抗原存在。
（6）检测90份阴性样品，利用阴性平均值土3SD，确定检测方法PI值大于50为阳性，小于50为阴性。
（7）液相芯片法敏感性研究
利用PCR方法对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D和出血性大肠埃氏菌O157细胞毒素进行检测，对抗原进行1:10、1:20、1:30、1:40、1:50倍稀释；当稀释倍数＜30时可检测出抗原存在；当稀释倍数＞30时，不能检测出抗原存在。而应用建立的液相芯片检测方法，样品稀释50倍，仍能检测出抗原。
表1 金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D基因片段引物序列。
大肠杆菌0157检测
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