三引物一步法构建融合蛋白基因fpg和其表达研究.pdfVIP

第三届环境模拟与污染控截学术研讨会论文 三引物一步法构建融合蛋白基因fPg及其表达研究 刘和，吴东雷，陈英旭 (浙江大学环境工程系，杭州3 10029) 芳烃化合物是一类常见的环境污染物，构建高效的基因工程菌来降解环境中的芳香烃类 污染物是环境生物技术研究的前沿领域。pheB基因编码的邻苯二酚2,3双加氧酶是许多芳香 烃降解过程中的关键酶，其活性决定了某些芳香烃污染物的降解速率和矿化程度。绿色荧光 蛋白(GFP)基因肋是一种使用非常广泛的报告基因。将pheB和g咖基因构建融合基因并 通过转基因技术转入到野生细菌宿主菌中表达，借助于GFP这一绿色荧光报告分子就可以对 转基因(或细菌、在污染环境中的降解活性、时空分布行为进行监测。 本文报道一种构建融合基因的新方法一“三引物PCR一步法”(TP．PCR)，用该方法构 建了一个含pheB和舒争两种基因的融合蛋白基因fPg并在大肠杆菌中进行了表达。 1材料与方法 1．1菌种与质粒 重组质粒pT 自Clontech公司。表达载体pGEX4T为浙江大学生化所张文波博士惠赠。 1．2模板与引物 在三引物PCR中，包含两种模板和三个引物，两种模板分别是pTeasy-pheB和pGFP—1． 物(I)。三条引物的序列如下： F。h。B引物：51～立立△!￡￡GATGAACAAAGGTGTAATGCG--3’ GGTCATGAA一3’ GGACTTGTATAG--3’ R。fp引物： 5’～GG堡丛卫墨rrATCTAGATCC 术有限责任公司完成。 1．3其它 PCR扩增、DNA的酶切、连接、转化、表达等常规分子生物学操作均按标准方法进行。 2结果与讨论 2．1融合基因触的构建 PCR扩增的结果经琼脂糖电泳分析，结果如图1所示。泳道l为三引物两模板PCR反应 融合基因大小应为1674bp(包含中间连接短肤的15bp以及两端引物的酶切位点序列12bp， 图1三91物两模板PCR扩增引物 1 2 M 一181—． 第三届环境模撒与污染控制学术研讨会论立 并去除了却出基因的终止密码子以及g彦基因的起始密码子6bp)，因此扩增产物与预计的大 小相符。泳道2为用引物Pph。B和K晕的扩增结果，由于缺少中间引物，不能扩增出融合基罔 片段。 实验结果表明，三引物PCR是一种快速方便的构建融合蛋白基因的方法。由于_}}需在一 个PCR反应中通过精心设计的三条引物将两个基因构建成为融合基因，同时还可在中间加入 所需的特殊序列，如连接短肽等，因此极大地方便了基因重组操作。同时，我们还可以在所 期望的任何位点将两种DNA片段连接起来，而不需知道DNA片段的限制位点，这为构建没 有适宜酶切位点的融合基因提供了便利。 2．2重组克隆载体和表达载体的构建与测序鉴定 将PCR扩增片段插入pGEM-T载体，转化宿主菌TGl，抽提质粒，筛选得到重组质粒， 命名为pTeasy-,@g。将该质粒进行测序，测序结果表明，融合DNA片段的序列与预期的完全 一致，融合基因的5’端为pheB基因序列，3’端为g彦基因序列，说明通过三引物PCR一步 法己经成功地构建得到含pheB和2彦两基因的融合基因。 2．3SDS电泳 l；阴性对照(茴体沉淀 2：阴性对照f上清液) 3；诱导(菌体沉淀) 4：诱导(菌体沉淀、 5：诱导(菌体沉淀) 6：诱导(上清液) 岫m∞∞出m