不可分型流行性感冒嗜血杆菌对气管黏膜上皮细胞作用的研究.pdfVIP

盟整壁鎏盘金塞逾 全国盟叠壁鎏：璺鏖垂塑：塑造塞亚缱 不可分型流行性感冒嗜血杆菌对气管黏膜上皮细胞作用研究 第二军医大学附属长征医院呼吸科(上海，200003)钱建美修清玉 不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)是一种无夹膜的革兰阴性球杆菌，常聚集在呼吸道、感染气道表面， 造成黏膜纤毛清除机制受阻或丧失。国外从慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重期患者痰中分离出 NTHi率达30％，国内达20％左右，缓解期约有10％。90年代以来，国外学者利用人支气管上皮细胞原 代培养及多种支气管细胞株模型，对NTHi的致病机制作了有意义的探索，但迄今尚少见国内有关报 道。我们利用气液界面无血清培养原代兔气道上皮细胞模型，对NTHi的致病作用作了初步探讨。 NTHi 为本院标准细菌株。 培养器皿：套m1．(3412型)为Costar产品，套皿用I型胶原以0．15 na／cm2铺膜，室温放置数小时备 用。 INS、0．1 培养基配制：在DMEM／F12中加入10 HC、10 TF、20 t,g／mi ng／mi pg／ml tc．／,a T3、25ng／mi EGF、7．5 ECGS、1 mmol HEPES、100 vg／-a mmol／L谷氢酰胺、30 1U／ml青霉素、50 tc．／ml链霉素为无血清 培养基(CM)。 气管上皮细胞分离和培养：气管上皮细胞分离和培养参照REEN及Tournier等方法，在无菌条件 下，取出气管用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗数次，气管喉端用4一塑料插管并结扎固定，注入0．1％蛋 白酶XIV少许，结扎支气管端，继续注入蛋白酶至充盈，插管封口，将整段气管浸没在冷的DMEM培养 000 基中，40℃，消化18小时。随后用含10％FCS的DMEM冲出消化液，1 r／min离心10小时，弃上清， 同上洗涤1次。 活细胞／crn2加入套皿，5％CO：，37℃培养，24小时后换为无血清培养基，上层培养基O．5ml，下层培养基 2ml，隔天换液1次，直至约第7天细胞融合长满后，移去上层培养基，仅加底层培养CM一(CM中去掉 EGF、ECGS和FCS)。气液界面形成和一些生长因子去除，利于上皮细胞分化成功能的纤毛上皮细胞。 细菌感染：将ATCCA9247 NTHi接种于改良的哥伦比亚巧克力琼脂培养基，5％c0237。C培养约 18～241,时。挑取平板中数个菌落于PBS中混悬，制成约109菌液，用PBS稀释lO倍，混均，取1ml用 无抗生素CM一稀释10倍，取200 m加入套皿杯内上，底层培养基用无抗生素CM一代替。在5％cO： 37‘c培养24小时后，移去上、下层培养基，PBS冲洗2次，2％戊二醛固定，置于4。C待作电镜检查。 透射电镜：取膜1％锇酸后固定，EPON 618包埋，制成超薄切片，常规醋酸铀．枸橼酸铅双重染色， HITACHI．SS00透射电镜观察。 扫描电镜：取膜1％锇酸后固定，酒精逐级脱水，HITACHI HCP-2』临界点干燥，BADTEC离子射导电， 菲利浦公司XL30ESEM环境扫描电镜观察。 结果表明，原