高效液相色谱法同时测定人血浆中乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽浓度.pdfVIP

高效液相色谱法同时测定人血浆中乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽浓度 1 1 1 2 2 3 戚静燕 鲍红荣 俞建平 陈振明 王 佶 王海燕 1 浙江省临安市人民医院药剂科 2 浙江大学生物工程系 3 浙江中医药大学药学系 乙酰半胱氨酸（NAC ）是一种巯基化合物，为还原型谷胱甘肽（GSH ）的前体，不仅作为黏液 溶解剂，且具有干扰自由基生成，清除已生成的自由基，调节细胞的代谢活性，预防DNA 的损伤， 调整基因的表达和信号转导系统，抗细胞凋亡，抗血管生成，抑制恶性肿瘤发展，抑制新生物的生 成和转移，保护肝脏细胞等作用。最近大量研究发现NAC 在艾滋病、癌症、药物及重金属中毒、心 脏病、帕金森病以及吸烟损害等方面具有广泛的作用。因其药理作用正受到更大的关注，对其药代 动力学的研究更显重要。目前国内文献报导主要集中在用HPLC 法测定复合氨基酸注射液（17AA） 中NAC 的含量。对于利用HPLC 测定NAC 血药浓度的方法未见报道。本研究在文献的基础上，建 立了HPLC 同时测定人血浆中NAC 和GSH 血药浓度的方法。 1 仪器与试药 Agilent 1100 高效液相色谱仪，附紫外检测器；Agilent Anke TGL-18G-C 高速离心机；SZ-1 型快 速混匀器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）。GSH 标准品（由杭州民生药业股份有限公司提供）； NAC 标准品（由重庆药友制药有限公司提供）；青霉胺（中国药品生物制品检定所）；5，5’-二硫 代双硝基苯甲酸（DTNB ，Sigma 公司）；甲醇（色谱纯，Merck 公司）；水（灭菌注射用水，浙江 平湖莎普爱思制药有限公司）。乙酸钠（NaAC ）、乙酸（HAC ）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na ）、 磷酸氢二钾（K HPO ）、三氯乙酸（TCA ）均为国产分析纯。 2 4 2 方法与结果 2.1 色谱条件：色谱柱Zorbax SB-C18 （4.6×250mm ，5µm ）及保护柱（美国Agilent 公司）；柱温 30 ℃； 流动相：0.05mol.L-1 -1 乙酸钠缓冲液（pH 5.6 ）：甲醇90:10 ；流速：1ml.min ；进样量：20µL ；检测 波长320nm 。 2.2 标准溶液的配制 对照品溶液：分别精密称取GSH、NAC 标准品各25mg ，各置于50mL 量瓶中，用2.7mmol/L 的EDTA-2Na 溶液溶解并稀释至刻度，即得质量浓度为500µg/mL 的标准储备液，并用其稀释成250 、 125、50、25 、5µg/mL 的GSH、NAC 系列浓度标准储备液。 内标储备液：精密称取青霉胺适量，用5000µg/mL EDTA 配制成约40µg/mL 的溶液作为内标溶液。 - 131 - -1 -1 衍生化试剂：以0.5mol.L K HPO 溶为溶剂，将DTNB 配制成100mmol.L 的溶液，备用。 2 4 以上试液均置冰箱内4 ℃以下保存，待用。 2.3 血浆样品处理 取空白血浆65µL，加入DTNB 溶液35µL，再加入内标溶液20µL ，加入25µL 测试浓度的NAC 、 GSH 标准储备液，漩涡混合30s，室温反应10min，加入10%TCA35µL 沉淀蛋白，漩涡30s，10000rpm 离心2min 。吸取上清液，20µL 进样，记录色谱图。 2.4 色谱行为 色谱图见图1。由图可见，血浆中成份不干扰GSH、NAC 和内标的测定。GSH、NAC 、内标保 留时间分别为5.68±0.18、11.40±0.72、21.77±1.35min 。 2.5