胚胎后肾间充质细胞对急性肾小管坏死再生修复的实验研究.pdfVIP

泌的ET-1可能参与了梗阻性肾病的发生和发展，肾皮质ET-1可作为肾小管周微血管损伤的指标之 一：联合应用干细胞因子和粒细胞集落刺激因子有助于保护血管内皮细胞或促进血管损伤的修复。 30．胚胎后肾问充质细胞对急性肾小管 坏死再生修复的实验研究 中南大学湘雅二医院小儿肾病实验室(长沙410011) 刘喜红，易著文，陈丹，何小解，莫双红 研究背景急性。肾功能衰竭(ARF)占住院病人的7％，死亡率根据研究的人群不同，为20％～ 70％不等，近20年来，尽管在支持治疗、护理和肾替代治疗方面取得了较大的进展，但ARF的死 亡率并没有明显的改变。ARF最常见的病因为急性肾小管坏死(ATN)，约占ARF的75％～80％。 肾小管坏死时小管上皮细胞出现丢失、小管基底膜脱落等改变，同时小管上皮有一定的修复能力， 在恢复过程中，存活的小管细胞出现增生、迁移至损伤部位，取代坏死细胞，从而起到修复肾脏的 作用。尽管一些生长因子可激发小管再生潜能，但修复的关键是要有足够多的活的小管细胞。近几 年，有较多的试验采用骨髓来源的千细胞，如间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)治疗ARF 或ATN模型，认为对损伤的肾脏有修复作用，但也存在许多争议。而目前已经证实胚胎后肾间充质 中存在干细胞，具有发育的多潜能性及自我更新的能力。该类细胞在正常状态下替代衰老凋亡的细 胞，维持细胞代谢的平衡；在病理情况下，则参与肾脏的再生修复，其分化过程与胚胎肾的发育过 程类似。本研究选用后肾问充质细胞经外周血管注射移植于庆大霉素诱导的急性肾小管坏死模型动 物，追踪观察其在体内定位、归巢和分化情况，探讨其对肾小管上皮细胞损伤后的修复和再生作用 及其可能机制，为临床急性肾小管坏死的细胞治疗提供理论基础和实验依据。 目的研究胚胎后肾间充质细胞移植对肾毒性急性肾小管坏死再生修复的作用及可能机制。 方法(1)体外培养和扩增胚胎后肾间充质细胞(RD蛆M．18细胞)；①细胞复苏后，采用含有 FGF2及100nmol／L 5％胎牛血清、iong／mL 1713一雌二醇的DMEM／F12培养基培养，定期传代；②光 镜及电镜观察细胞形态；③采用免疫细胞化学染色法对细胞进行生物学特’陛的鉴定：④移植前分别 用DAPI、Brdu标记并分别计算标记率；⑤MTr法检测细胞活力。 (2)庆大霉素诱导急性肾小管损伤模型：采用总量900 rag的庆大霉素皮下注射，3天成模。 (3)细胞移植：分为ATN细胞移植组、ATN培养基对照组、ATN对照组和空白对照组。①成模 注射lml无血清的培基：③移植后1d、4d、1w、2w、4w时分别处死大鼠，留取尿、血及肾标本。 (4)指标检测：①细胞定位检测：分别采用荧光显微镜观察肾脏DAPI阳性细胞及抗Brdu免疫 组化方法检测Brdu阳性细胞；②肾小管和肾小球功能检测：BUN、SCr、尿蛋白、B2．微球蛋白、 NAG等：⑨肾脏病理检测：HE，PAS染色：④肾小管上皮细胞凋亡检测：采用TUNEL法：⑤肾 TNF-a、bFGF、Bcl．2 ．132． 性免疫排斥反应检测：分别采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8比例及 CD4／CD8比值；ELISA法检测血清1I．-2、INF-I水平。 结果(1)细胞培养：①细胞呈成纤维细胞样、梭形、贴壁生长；②细胞免疫化学为波形蛋白 (2)庆大霉素诱导急性肾小管坏死：900mg总量，3天可成功制造急性肾小管坏死模型，造模 第2天即出现尿量增多、部分大鼠出现血尿．采用首剂加大法可有效地减少死亡率； (3)胚胎后肾间充质细胞尾静脉注射移植：①细胞移植组大鼠死亡率明显降低；②肾功能明 显改善：③移植后各时间点均可在肾小管检测DAPI阳性或Brdu阳性细胞：④。肾脏病理明显减轻： ⑤肾小管凋亡明显减少，增生增加；⑥肾脏局部bFGF抗炎性因子上调，IL-1]]，TNF．嘏炎症因子下 调。 ． (4)免疫排斥反应检测：各组间T淋巴细胞亚群比例及血清IL-2、INF-v比较显著性差异。 结论 (1)RIMM一18细胞体外多次传代后仍能保持