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猪子宫内膜上皮细胞的分离培养 袁晓龙，曾检华，陈炫，尹琪，李加琪+ (广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室， 华南农业大学动物科学学院，广N510642) 引言 子宫内膜主要由上皮细胞和间质细胞组成，不仅是一个保护性内膜，而且是具有多 种分泌功能的内膜。胚胎着床阶段是母猪怀孕后胎儿死亡的高峰期之一，而胚胎着床是 与子宫内膜上皮细胞紧密相连的，所以对子宫内膜上皮细胞进行体外培养，探讨子宫内 膜上皮细胞分离与体外培养条件、生长特点及其增殖过程，为进一步研究子宫内膜上皮 细胞在胚胎附置时的作用，提供理论依据和实验模型。 材料与方法 屠宰场采集卵泡期子宫，于切口处结扎，迅速放入冰盒带回实验室。用75％酒精擦 拭子宫外表面，PBS冲洗2-3遍。在超净台内，沿子宫角纵向剪开，用PBS冲洗2次。用 剪刀把矛宫内膜上皮组织剪成条状，置PBS中冲洗，直至液体清亮，剪成lmm3的肉泥 状，接种于培养瓶，用0．1％胶原蛋白酶I，37。C水浴摇床消化2．5h，加入等量的终止液 (含10％FBS胎牛血清的DMEM)终止消化。把消化液和终止液的混合液过100目细胞 500r／min离心5min，弃上清。完全培养液将细胞沉淀吹打悬浮，细胞计数后，以 后，以后隔2—3d更换培养液1次。培养到细胞几乎聚合成片，大约需要5-7d时间。传代培 圆透亮悬浮时，立即加入等体积的终止液终止消化，吹打数次，将细胞悬浮液转入至离 清，将细胞沉淀悬浮接种于新细胞培养瓶中培养。 结果 猪子宫内膜上皮细胞，在培养24h后基本已贴壁，并成漩涡状排列的致密单层细胞 集落，偶见散在的间质细胞插入性生长。培养2d后，上皮细胞80％融合，呈梭形，边界清 楚，排列紧密，胞质呈颗粒状，胞核大而圆，核仁明显，细胞集落扩大并相互融合成 片，培养液颜色变淡、变浑浊。培养第3d上皮细胞基本铺满25cm3的培养瓶，细胞呈梭 形，生长旺盛，可以体外进行传代培养，一般可连续培养6代左右，之后细胞形态会发生 改变，细胞变大，由梭形向成纤维状转变，集落漩涡状向散在单个生长，贴壁及生长速 度变缓。 讨论 在猪子宫内膜上皮组织获取后。用胶原蛋白酶消化，把消化液和终止液的混合液过 100目细胞筛过滤，滤液吸至离心管，500r／min离，tj,5min，此时上清中主要为间质细胞， 沉淀主要为上皮细胞。在子宫内膜上皮细胞纯化时，主要利用间质细胞和上皮细胞贴壁 的时间不一样，巧妙的把两种细胞分开。本研究建立的猪子宫内膜细胞培养方法，可在 短时间内获得足够数量的子宫内膜上皮细胞，并可以体外培养，为研究子宫内膜上皮细 胞在胚胎附置时的作用，提供了一个理想的实验模型。 关键词：猪：子宫内膜上皮细胞：分离培养 致谢：本研究由现代农业产业体系专项(CARS一36)资助。 木通讯作者，李加琪：jqli@seau．edu．cn。