人微列、RNA-133a（miR-133a）重组腺病毒的构建和鉴定.pdfVIP

维普资讯 · 1402· 理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiolo~ 2007r23(7)：1402-1407 [文章编号] 1000—4718(2007)07—1402—06 人微 、RNA一133a(miR一133a) 重组腺病毒的构建和鉴定木 张 斌 ， 单志新 ， 林秋雄 ， 周志凌 ， 邓春玉 ， 郭爱林 ， 符永恒 ， 谭虹虹 ， 余细勇 (广东省人民医院医学研究中心 ，广东省心血管病研究所 ，广东 广州 510080) [摘 要] 目的：构建人miR一133a重组腺病毒 ，研究其在人骨髓间充质干细胞 (hMSCs)中的表达。方法： 从人基因组 DNA中扩增包含miR一133a的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体 pAdTrack—CMV。将经pmeI 线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy一1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺 病毒质粒rAd—mir一133a。将rAd—mir一133a在人胚肾293细胞(HEK293)中包装并扩增出miR一133a的重组腺 病毒。将重组腺病毒感染 hMSCs，利用RT—PCR和实时定量PCR分别检测初级 miR一133a和成熟 miR一133a的 表达。结果：限制性内切酶分析和DNA测序结果显示 ，重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack—CMV—miR一133a构建正 确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒 rAd—miR一133a。rAd—miR一133a感染的hMSCs中初级 miR一133a转录子和成熟miR一133a表达显著增强。结论：成功构建了人 miR一133a重组腺病毒，并在hMSCs中 高效表达出miR一133a，为进行 miR一133a的功能研究创造条件。 [关键词] 微小 RNA；载体构建；骨髓间质干细胞；腺病毒 [中图分类号】 Q78 [文献标识码】 A Construction ofrecombinantadenovirusvectorcarryinghuman miR ．． 133aand itsexpressioninvitro ZHANGBin，SHANZhi—xin，LINQiu—xiong，ZHOUZhi—ling，DENGChun— yu ，GUOAi—lin ，FU Yong—heng ，TAN Hong—hong ，YUXi—yong (ResearchCenterofMedicalSciences，GuangdongProvincialPeoplesHospital， GuangdongPrvoincialCardiovascular DiseasesInstitute，Guangzhou51008O，China．E—mail：yuxycn@hotma il．corn) [ABSTRACT] AIM ：ToconstructrecombinantadenoviursvectorcarryinghumanmiR一133aandstudyitsexpres— sioninhumna mesenehymalstem cells(hMSCs)．METHODS：ThePCRproductcontainingmiR一133awasamplified from humna genomicDNA andinsertedintotheadenoviral shuttlevectorpAdTrack—CMV．Thentherecombinantshuttle plasmidlinearizedbypmeIWas eotransformedintocompetentE．coli．BJ5183withtheadenoviralbackboneplasmid pAdEasy一1togeneratetherecombinant