重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定.pdfVIP

· 1526· 屯国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2012，28(8)：1526—1531 [文章编号] 1000—4718(2012)08—1526—06 · 实验技术 · 重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的 表达、纯化及活性测定木 冯成利 ， 项 琪 ， 张齐好 ， 杨 艳 ， 柯 实 ， 黄亚东 ， 苏志坚。，。 (。陕西省动物研究所 ，陕西 西安710032； 暨南大学 广东省生物工程药物重点实验室，基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632) [摘 要] 目的：利用巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)重组表达人角质细胞生长因子(humankeratinocyte growthfactor，hKGF)，为实现规模化生产重组 hKGF奠定基础。方法：根据已报道的hKGF成熟肽序列，人工合成 由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的DNA片段后连接到分泌型表达质粒pPICZotA中，获得重组表达质粒 并转化毕赤酵母x一33中进行表达。优化发酵条件，并利用5L生物反应器进行中试发酵。发酵上清通过超滤及 层析方法分离纯化重组蛋白，并利用MMT法检测其对恒河猴肺上皮细胞的促增殖活性。结果：在20℃，甲醇诱导 60h后 ，获得分子量约为28kD的 目的蛋白，表达量约占菌体上清总蛋白的14．1％。发酵液经肝素亲和层析和 SephardexG一25分子筛分离获得纯度为95．0％以上的重组蛋白，得率为 12mg／L。该重组hKGF具有糖基化修饰 ， 能显著促进恒河猴肺上皮细胞增殖，其ED∞约为57 L。结论：利用毕赤酵母成功表达出糖基化修饰及具促恒 河猴肺上皮细胞增殖活性的重组hKGF。 [关键词】 人角质细胞生长因子 ；毕赤酵母 [中图分类号] R331 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2012．08．036 Expression，purificationandactivitydeteminationofrecombinanthuman keratinocytegrowthfactorinPichiapastoris FENGCheng—li ，XIANGQi，ZHANGQi—hao，YANGYan，KEShi，HUANGYa — dong ，SUZhi—iian (ShaanxiInstituteofZoology，Xian710032，China；GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBioengineenngMedicine， NationalEngineeringResearchCenterofGeneticMedciine，JinanUnivemity，Guangzhou510632，China．E—mail：$1Z— zhijian@126．tom) [ABSTRACT] AIM ：Todeterminetheconditionsofrecombinanthumna keratinocytegrowthfactor(hKGF)ex— pressionforlarge—scaleproductionusingPichiapastoris(P．pastoris)．METHODS：TheDNAfragmentencodinghKGF maturepeptidewasartificial synthesized．Thisartificial gene，whichconsistedof20codonsofpreferenceinP pastoris， wasclonedintosecretoryexpressionvectorpPICZotA nadtrnasformedintoP pastorisX一33strain．Undertheoptimalcon-