骨桥蛋白在不同胆汁体系中的成核作用研究.pdfVIP

[2] 重要作用。胆固醇结石成因包括胆固醇过饱和、胆汁成核异常胆囊功能改变 ， 而胆汁中胆固醇成核异常则起了关键作用，国内外研究者已在胆汁中分离除许多 具有成核和抑成核作用的蛋白质及相关离子，并通过体外模拟胆汁体系和人胆囊 [3-5] 胆汁的研究探讨其对结石成核的影响 ，华山医院胆石病课题组发现了33.5kD、 [6，7] 200kD 的成核蛋白 。研究表明骨桥蛋白（osteopontin，OPN ）参与钙离子代 谢及组织矿化，而这两种作用均与结石形成密切相关，而未见有关OPN 与胆固 [8] 醇结石的研究报道 。因此，我们利用体外模拟胆汁体系及人胆囊胆汁研究OPN 的成核作用，探讨OPN 与在胆固醇结石形成的关系。 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 胆固醇、卵磷脂、脱氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠、胆红素Ⅸa、白蛋白及OPN 均购自Sigma 公司，氯化钙、甲醇、氯仿、依地酸钠级叠氮钠等其他试剂均购自 上海市化学试剂公司，均为分析纯级。主要仪器：0.22µm 滤膜（华美公司）、偏 光显微镜（Olympus 公司），超速低温离心机为Biofuge公司产品，恒温培养箱 及旋转蒸发仪（复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系。 1.2 模拟胆汁制备 [9] 参照改良的Kibe 法 ，控制总脂浓度(胆盐+卵磷脂+胆固醇)100g/L，胆固醇 饱和指数1.2，胆盐/磷脂比4 ，具体成份比例：胆盐129.54mM，磷脂32.38mM， 胆固醇13.56mM。混合胆盐（溶于甲醇）、卵磷脂（溶于2:1 氯仿:甲醇）与胆固 醇（溶于氯仿），旋转蒸发仪挥发有机溶剂并冻干后加入缓冲液（含1mM EDTA， 3mM 叠氮钠，150mM 氯化钠，25mM Tris-HCl，pH7.45 ）,55℃搅拌至溶液均匀 透明，经0.22µm 滤膜过滤，备用。 1.3 人胆囊胆汁制备 结石胆汁取自我院外科行择期胆囊切除的胆结石患者，男 9 例，女 1 例，平 均年龄（43±6 ）岁，所有患者均经病理及B 超证实；对照组胆汁取自上海市第 一医院普外科及我院普外肝移植之供体，男 9 例，女 1 例，平均年龄（38±6 ）岁。 两组患者均符合列下标准：① 结石中胆固醇含量均65%；② 20 岁 年龄60 岁；③ 胆囊无急性炎症；④ 胆囊无萎缩，硬化；⑤ 肝、肾功能指标正常；⑥ 胆 汁常规细菌培养结果为阴性；⑦患者无糖尿病、肿瘤。 [10] 胆囊胆汁按照 Strasberg 描述方法 ，每次根据具体情况取6- 10ml，将所有 胆囊胆汁分装于无菌管中，于4 ℃ 15000g 离心15min，去除组织碎片等杂质， 再加入胆汁保存液（0.05%氯霉素、3mM 叠氮钠、1mM 亮抑酶肽和5mM 依地酸 钠）置于-79℃备用。 1.4 Holan法测定成核时间[11] 模拟胆汁（每组 8 个样本）及人胆囊胆汁37℃ 45000rpm 超速离心 30min 后，0.22µm 滤膜过滤，每管胆汁为480µl，分别加入20µl OPN，白蛋白、氯化 钙，总体积 500µl 控制；置于 37℃恒温箱培养，平衡30min 后做为实验零点， 以后每24h 在偏光显微镜下观察带有折光性的胆固醇结晶析出，直至所有标本均 出现结晶，则为实验终点。记录每个样本出现胆固醇结晶的时间，即为成核时间。 实验组分别为白蛋白（对照100µg/ml ）、OPN （50µg/ml）、OPN （100µg/ml）、 氯化钙（10mmol/l）、OPN （50µg/ml）+氯化钙（10mmol/l）和OPN （100µg/ml） +氯化钙（10mmol/l）。 1.5 结晶生长试验（Busch 法）[12] 此实验仅用于模拟胆汁，每组6 份的480µl 模拟胆汁。分别加入OPN ，白蛋 白、氯化钙，控制蛋白浓度为100µg/ml，溶液体积为500µl；37℃平衡15min 计