影响Bt75几质酶基因chiB表达类型关键碱基的确定.pdf

中文摘要 中文摘要 几丁质酶在工、农、医药等各个领域具有重要的应用前景。研究表明苏云 金芽胞杆菌(Bacillus 调节。但Bt几丁质酶基因(chi)具体调控过程，基因表达的重要遗传元件，至 今国内外未见任何报道。本研究所用材料Bt75菌株，其几丁质酶ChiB亦属明 显诱导类型。本研究从Bt75几丁质酶基因chiB上游包括潜在全长启动子在内的 调控序列入手，通过一系列缺失、定点置换等方法研究几丁质酶ChiB的表达类 型，确定影响幽诏基因表达方式和启动子效率的关键部位，以及调控几丁质酶 表达类型的关键碱基。本研究为利用和改造微生物几丁质酶功能基因、为构建 组成型启动子，以及为最终阐明Bt75几丁质酶基因表达调控机理提供理论研究 基础。 首先在Bt75几丁质酶基因chiB全长调控序列的基础上设计一系列缺失，将 PCR方法获得的一系列缺失的片段与启动子探测型载体pCB相连，构建出一系 列重组载体，然后经电转化到原始菌株Bt75中。通过测定载体pCB上报告基因 bgaB表达的B．半乳糖苷酶的酶活，发现上游调控序列．232位到．121位之间的区 域对于chiB基因的有效表达是必不可少的，应该是核心启动子区域。在系列缺 失的测定结果中，发现将．504位至．97位的DNA片段连上载体pCB后，转化子 为诱导型表达，而．504位至。100位之间区域连上pCB后，为组成型表达。据此 结果推测在．100位至．97位之间有调控chiB表达类型的关键碱基位点。基于上 述结果设计定点置换一99和．98位碱基。定点置换后获得系列置换突变子，经研 究各个突变子的酶表达特性后，发现这2个碱基双置换和单置换后，多数突变 子的表达类型由原来的诱导型变为组成型。在全长调控序列上再次重复典型组 成型的的突变后，结果与分步缺失一致。经无诱导物培养突变子后，通过Northem blotting杂交验证，突变二子中基因转录明显增高。上述结果证明chiB基因调控系 列中．99和．98位碱基在几丁质酶表达类型调控中起重要作用。推测应该是阻遏 蛋白结合的关键位点。 此外，本研究将几丁质酶表达类型不同的启动子片段，连接载体pCB载体 后，经电转化方法转进亲缘关系和遗传背景相近的其他宿主菌中后，发现这些 宿主菌对供体菌的c办i基因的表达类型有影响，改变了供体菌启动子调控的B． 中文摘要 半乳糖苷酶的表达类型，推测是与宿主菌中特定的调控蛋白有关。 由于宿主菌对供体菌的几丁质酶启动子的功能有影响，故寻找宿主菌中调 控几丁质酶启动子的调控蛋白成为研究的重要内容，本研究通过选择克隆表达 全局性代谢调控蛋白CcpA，经过纯化已获得正确的蛋白。这些研究结果为Bt 菌株中几丁质酶表达调节因子的确认奠定基础。 关键词：Bt几丁质酶；chiB；表达类型；定点置换；关键碱基；调控蛋白 Abstract Abstract were Studiesshowedthatchitinase synthesizedinducer／repressorsystem by inBacillus chitinaseChiBofBt75straininthis is regulation thuringie聆s西．The study from。the1viewof constitutivedchitinaseismore chitin-dependent，butapplication，the the the of conducivethan studieson induced[one．Therefore，the