谈枳壳甘草汤对腰椎间盘突出模型大鼠炎症及退变的影响.docVIP

谈枳壳甘草汤对腰椎间盘突出模型大鼠炎症及退变的影响 　　腰椎间盘突出症(LDH)是脊柱外科疾病中发病率最高的一种疾病， 一个人一生中发生下腰痛的概率大约是80%，而其中20%～30%是因LDH 引起的。其中炎症介质在神经根病变中起着重要的作用， 炎症介质可以诱使人体的神经纤维组织产生炎性变化、超敏化及神经纤维的脱髓鞘改变; 这些炎症介质还使得神经根及相邻部位的神经纤维感受器处于兴奋状态。从而成为LDH 神经根性疼痛的重要原因之一。1990 年Saal 等在LDH 患者手术摘除的髓核中，发现磷酯酶A2(PLA2)活性显著升高，证实了椎间盘组织中PLA2炎症介质的存在。随后炎症介质在临床中引起人们的注意。1995 年Ozaktay 等通过实验在兔子腰关节囊及附近组织中注入PLA2，解剖后发现注射部位出现了炎症及神经毒性反应， 说明在突出的椎间盘髓核中PLA2 具有高度引起局部炎症的特性。现代有研究表明，当人体的椎间盘发生退变时，可在退变的组织中检测到多种炎症细胞因子， 如肿瘤坏死因子-alpha; (TNF-alpha;)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等。而TNF 是在炎症产生中最早出现和起到重要作用的炎症介质。 　　TNF 可诱发机体产生中性粒细胞及淋巴细胞， 并能促进其他炎性细胞因子的聚集和分泌。这些炎症介质可引起细胞的毒性作用，从而释放过氧化物酶、NO 等物质。这些物质会导致软骨终板细胞的损害，使得椎间盘软骨细胞溶酶体丧失稳定性， 进而导致细胞膜脂类代谢、糖代谢发生紊乱，最终引起软骨终板细胞出现坏死和钙化， 这种变化会使退变的椎间盘产生严重的营养障碍， 从而加速椎间盘组织的退变步伐。本实验通过观察枳壳甘草汤对大鼠腰椎间盘突出模型髓核中PLA2 活性及其对IL-6、TNF-alpha; 的影响，为枳壳甘草汤提供实验依据。现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验 　　动物选取3 月龄SPF 级SD 雄性大鼠90只，体质量(200plusmn;20) g，由苏州市中药研究所提供。动物实验环境：清洁级，温度控制在22 ℃左右，湿度在65%左右。实验过程中完全符合《关于善待实验动物的指导性意见》标准。 　　1.2 药物 　　与试剂中药饮片：枳壳甘草汤组成为枳壳10 g，甘草6 g，当归10 g， 丹参10 g， 三棱10 g， 莪术10 g， 牵牛子丑5 g ( 枳壳批号 甘草批号 当归批号 丹参批号为201500821; 三棱批号 莪术批号牵牛子批号为201500409，均购自苏州春晖堂饮片厂)。加冷水500 mL，浸泡30 min，煮沸后煎30 min，取汁200 mL;再加水300 mL，煎30 min，取汁200 mL，两次相兑，并浓缩成1.5 g/mL 煎剂，保存于恒温冰箱中备用。吲哚美辛胶囊(25 mg/粒，苏州第三制药厂有限责任公司，批号：150409);PLA2 Elisa 测定试剂盒(批号：201601，南京建成生物科技有限公司);戊巴比妥钠(批号：101087，Sigma 公司);注射用青霉素G 钠(0.48 g，80 万U，山东鲁抗医药股份有限公司);红霉素软膏(0.5%，批号：150107，新乡华青药业有限公司);TNF-alpha;(货号Sc-374433， Santa 公司);IL-6(货号Sc-1265，Santa 公司);抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(货号：K5007，Dako Denmark A/S 公司);血清(驴血清)(目录号：MP-7401，VECTOR-LAB 公司)。 　　1.3 主要仪器 　　Labsystems Finnpipette 100 mu;L 单道移液器(南京建成生物科技有限公司);Thermo 50mu;L 8道移液器(南京建成生物科技有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);华东电子DG5033A酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。 　　1.4 模型制备 　　1)椎间盘的获取：将SD 雄性大鼠90 只，体质量(200plusmn;20) g，经2%戊巴比妥钠(30 mg/kg) 腹腔注射麻醉并固定大鼠四肢， 用组织剪剃除大鼠背部体毛。常规消毒后铺无菌单，并用橡皮筋扎紧大鼠尾部。操作员在无菌环境下每只大鼠取第3、4 尾椎的椎间盘两个(椎间盘包括上下软骨终板)。取出的椎间盘采用10 mL 针头刺破椎间盘正中的纤维环，暴露出髓核，从而造成成破裂形态，放在生理盐水中备用。 　　2)椎间盘的埋植：碘伏常规消毒背部，取后背正中切口，以L5 棘突为中心，长约2 cm，切开皮肤、肌肉、将椎