聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ.pdfVIP

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2008，28(4)：17～20 聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体 Ⅱ 牛晓霞’周敏毅 刘金毅 孙 超。钟 茜4吴晓东 (1中国科学院研究生院 北京 100049 2北京三元基因工程有限公司 北京 102600) (3中国药科大学药学院 南京 210009 4中国药科大学中药学院 南京 210009) 摘要 目的：用聚乙二醇(PEG)修饰集成干扰素突变体 11(IFN—Con—m2，IIFNm2)，通过纯化获得 新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋 白酶水解稳 定性及初步药代动力学研 究。方法：将 mPEG20000定点偶联到 IIFNm2的第 86位 Cys残基上，修饰后的产物经 CM层析后，以SDS— PAGE考察其纯度 ，用WISH—VSV系统进行生物活性测定；在0．1％胰蛋 白酶条件下考察体外抗酶 解稳定性；并以SD大鼠进行初步药代动力学研究，绘制血药浓度一时间曲线。采用3P87软件进行 数据拟合，分析药物动力学参数。结果：干扰素修饰率约为50％，且绝大多数以单修饰体 (mono— PEG—IIFNm2)形式存在；提纯后mono—PEG—IIFNm2的纯度大于98％，比活性约为修饰前 IIFNm2 的1％。抗胰蛋白酶水解试验表 明：30min后，IIFNm2抗病毒活性残留为8％，mono—PEG—IIFNm2 为41％。初步药代动力学研究显示：IIFNm的消除半衰期为 (1．57-4-0．34)h，mono—PEG—IIFNm2 为(180±4．0)h。结论：成功地偶联 了PEG和 IIFNm2，建立 了mono—PEG—IIFNm2的纯化工艺， PEG修饰能增加 IIFNm2的体外抗胰蛋 白酶水解稳定性，并显著延长体 内半衰期 。 关键词 集成干扰素突变体 定点聚乙二醇修饰 药代动力学 半衰期 中图分类号 Q503 干扰素d能够治疗多种肿瘤和病毒性疾病，但是 1 材料与方法 由于血清半衰期太短，病人需要隔 日甚至每 日注射才 能达到理想的治疗效果。 1．1 材 料 聚乙二醇化技术是一种改善治疗性蛋白质在体内 人羊膜细胞 (WISH)、水泡性 口炎病毒 (VSV)，为 运输的有效方法，经临床验证，PEG修饰可以显著改善 三元基因工程有限公司保存。mPEG20000购 自北京键 蛋白质类药物体内药代动力学性质 。 凯科技有限公司，IIFNm2原液为三元基因工程有限公 本课题组曾利用定点突变技术，构建集成干扰素 司生产。DEAESepharoseFF，CM SepharoseFF购 自 突变体 Ⅱ(IFN—Con—m2，IIFNm2)，在 86位引入一个 AmershamPharmacia公司。 Cys，获得兼具高活性和可用PEG定点修饰的干扰素新 sD大鼠，250～300g，雌雄各半，购 自协和动物所实 分子 。 验动物中心。 本文拟在上述研究 的基础上，利用马来 酰亚胺 1．2 方 法 PEG衍生物对多肽分子内的Cys残基进行定点修饰， 1．2．1 IIFNm2的浓缩 将 IIFNm2用 A液 (25reotol／ 并对修饰产物进行抗胰蛋白酶稳定性研究和初步药代 LTris—HC1pH8．0)稀释后上样到 DEAESepharoseFF 动力学试验，为临床开发提供试验依据。 层析柱，上样量至50mg／ml填料。先用2个柱体积的A 液冲洗，再用 2～3个柱体积 的B液 (25mmol／LPB pH7．6)冲洗，最后用C液(25mmol／LPB +0．5mol／L 收稿 日期：2007—12—12 修回日期：2008-01-21 北京市科技计划重