生物化学实验-酶联免疫吸附试验.pptVIP

实验九  酶联免疫吸附试验 (Enzyme ?Linked?Immunosorbant?Assay，ELISA) 1、掌握抗原和抗体的制备方法 2、掌握酶联免疫分析抗体效价的方法 实验目的 实验原理 用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。最后通过酶作用于底物后显色来判断结果,可根据反应颜色的深浅进行定性或定量分析。 ELISA的基本原理有三条 1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； 2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅与相应抗原或抗体的量成正比例，因此可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA 的特点与方法 特点： 高灵敏度——可检测ng甚至pg水平,可作定量测定; 操作简便快捷，可以同时检测数十甚至上百个样品 安全性高，污染小，干扰小 缺陷： 对试剂的选择性很高,不能同时分析多种成分; 对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应,分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。 测定方法：常用的ELISA的测定方法分为三类:测定抗体的夹心法; 测定抗原的双抗体夹心法; 测定抗原的竞争法 1、动物免疫实验? 　 按1∶1的比例混匀褐腐病菌抗原与福氏完全佐剂并乳化完全后，以 1.0mg/kg 剂量多点肌肉注射进行初次免疫；分别间隔2周，按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后，1/2剂量进行第 2、3 次免疫；然后再分别于第8、11、13周，按1∶1的体积比混匀抗原与福氏不完全佐剂并乳化完全后，以1.0mg/kg剂量加强免疫。 卵黄抗体的制备方法 2、鸡卵黄抗体的提取? 使用卵黄分离器分离卵黄，去除卵清蛋白和卵黄膜，收集卵黄，加6倍于卵黄体积的蒸馏水，用0.1 M盐酸调pH至5.0，搅匀后4℃放置过夜，4℃ 10000 r/min离心25 min，取上清液待测。 3、鸡卵黄抗体（IgY）的效价检测? 以沙门氏菌抗原为包被抗原，1%BSA作封闭剂，待测鸡卵黄抗体IgY为第一抗体，辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG为第二抗体，TMB为底物（OD）。OD450/630nm值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为其抗体效价。 实验器材： 酶标板，恒温箱，酶标仪 。 实验试剂： 沙门氏菌抗原，包被液，封闭液，结合物稀释液，底物缓冲液，洗涤液，底物工作液，终止液，待测一抗，HRP标记兔抗鸡二抗。 酶标仪 操作步骤： ①特异性抗原包被于酶标版（固相载体），4℃过夜，洗涤3次。加100 μl封闭液，37℃温育1 h 。 ②加100 μl待检标本，经过温育1h使相应抗体与固相抗原结合，洗涤3次 ，除去无关的物质。 ③加100 μl酶标二抗，与已结合在固相抗体上的抗原反应，37℃温育1h。洗涤，除去未结合的酶标抗体。 ④加底物显色20min，加50 μl 终止液终止反应，用酶标仪测量光密度值450/630nm，计算抗体效价。 思考题： 1、单克隆抗体和多克隆抗体的区别？ 2、ELISA的测定方法分为几种？ 4、ELISA的特点？ 结 束 ！