动物基因工程教学讲义.ppt

第七章动物基因工程 第一节 基因工程概述 基因工程(Genetic engineering)是一种DNA重组技术，它是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必须与载体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程也叫做重组DNA技术。 基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分离或合成；(2)用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；(3)把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（5）重组体细胞的鉴定与筛选。 基因克隆示意图 第二节 工具酶 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 常用的工具酶 限制性核酸内切酶 细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶 甲基化酶 识别特异的位点—酶切位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 配伍末端 二、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶I (全酶) (E. coli DNA Polymease) （二）K1enow片段(E.co1i) （三）T4 DNA聚合酶 (T4噬茵体感染的E．co1i) （四）Taq DNA聚合酶(Thermusaqraticus) （五）逆转录酶（reverse transcriptase） （六）末端转移酶 三、DNA连接酶 在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催化DNA中相邻的 3’一OH和5’一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。连接反应的最适温度是37℃，但在此温度下粘性末端之间氢键结合很不稳定。实验表明，15℃对于连接反应和粘性末端氢键结合的稳定性都是合适的。 四、甲基化酶 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C)。 ? 五、核酸酶 （一）核酸酶S1 (Nuclease S1) 核酸酶S1主要用于：(1)分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位。 (2)切除DNA片段上的单链末端，形成平末端。(3)切开cDNA合成过程中形成的发夹环。 (4)在限制酶位点上产生小缺失。 (二)核酸外切酶III （三）核酸外切酶VII （四）DNA酶I （五）RNA酶A (牛胰) （六）RNA酶TI （七）RNA酶H 作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点： 作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点： ① 在宿主细胞中能独立自主地复制。 ② 表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿 主细胞中表达。 ③ 容易从宿主细胞中分离纯化。 ④ 载体DNA基因组中有一段不影响它们复制的非必需区域，插在其中的靶片段能被动地跟着载体DNA一起复制，就像载体的正常成分一样。 一、质粒载体(plasmid vector) （1）质粒的一般性质 1．质粒的概念 质粒是细菌细胞染色体外存在于细胞质中能进行自我复制的一类小型DNA分子，大部分质粒为双链环状。 2．质粒的大小 3．质粒的拷贝数 4．质粒的不亲和性 5．质粒的宿主范围 质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志 3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一） （二）?噬菌体载体(? Phage vector) ?噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛采用的载体。?噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25％仍不失活，这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA。 与质粒载体相比，λ噬菌体作为载体可以克隆更大一些的DNA片段，欲构件一个基因文库，往往可以减少文库中克隆的数量。 （三）柯斯质粒载体（Cosmid vector） 柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建