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关于抗CD3 单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定 【关键词】单链抗体 【关键词】CD3 分子； 单链抗体 【Abstract】 The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions (VH and VL) were cloned by RTPCR from OKT3 hybridoma cells， which produced antiCD3 moleclonal antibody. The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv (scFv). The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface. By three panning rounds， we have obtained two singlechain antibodys that specific for CD3. The antiCD3 scFv will be a reagent for diagnosis and therapy of immunodisorder 1 实验资料 杂交瘤细胞OKT3 来自ATCC.质粒 pCANTAB5E，大肠杆菌TG1 和HB2151，内 切酶SfiI 和NotI， 可变区引物均购自Pharmacia 公司.Taq DNA 聚合酶，mRNA 磁性分离试剂盒购自Promega 公司.以分泌抗CD3 单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞 OKT3 为原始材料，采用Promega 公司试剂盒，从大约107 细胞中分离和纯化 mRNA，合成cDNA 第一链.通过RTPCR 分别扩增出重链可变区（VH）和轻链可变 区（VL）基因. 为了加强抗体轻、重链可变区（Fv）的稳定性和更好地维持抗 体分子内结合抗原区的空间构象，在VH 和VL 基因之间用一段编码(Gly4Ser)3 的DNA 序列把二者连接起来， 构成抗体可变区单链融合基因.为了把单链抗体 基因插入pCANTAB5E 质粒，我们以单链抗体基因为模板，引入一对含SfiI 和 NotI 酶切位点的引物， 再次 PCR 扩增.扩增产物Mr 约720，基因大小与预测 的单链抗体基因相符合（图1）.把单链抗体基因插入到表达载体pCANTAB5E 所 含的噬菌体外壳蛋白g3p 基因中. 转化大肠杆菌TG1 感受态细胞后，在辅助噬 菌体M13K07 的作用下，单链抗体和外壳蛋白g3p 以融合蛋白的形式表达于噬菌 体的表面，形成一个抗CD3 单链抗体文库.以外周血单核细胞为抗原，用ELISA 方法鉴定噬菌体抗体的免疫活性.首先用细胞分离液分离外周血T 细胞，然后包 被在经多聚赖氨酸处理过的96 孔酶联板上.分别与重组噬菌体抗体温育1 h， 用PBS 淋洗3 次后，加入HRP 标记的抗M13 噬菌体抗体温育1 h， 再用PBS 淋 洗3 次，加入底物进行颜色反应.用酶标仪在490nm 处检测每孔的吸收值.挑选 阳性克隆，感染大肠杆菌，获得培养上清，再进行免疫活性鉴定.经过三轮亲合 －感染－扩增的免疫筛选过程，使CD3 重组噬菌体抗体得到富极. 随机挑选12 个重组噬菌体抗体克隆进行ELISA 检测.从中选出免疫活性最强的两株阳性克隆. 把这两株阳性克隆的基因转入大肠杆菌HB2151，经IPTG 诱导培养后，可在上 清中收集可容性单链抗体.ELISA 进一步证明该抗体能够特异识别外周血单核细 胞和淋巴母细胞性白血病细胞，而不结合黑色素瘤细胞和人宫颈癌细胞(图2). 说明单链抗体保留了原单克隆抗体的抗原特异性. 1:1 kb 标准分子量；2:抗体VL 基因PCR 扩增产物；3：重组质粒经XbaI 和BamHI 双酶切，鉴定VL 基因；4：抗体VH 基因PCR 扩增产物；5：重组质粒 经Xho Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切，鉴定VH 基因. 图1 琼脂糖凝胶分析PCR 产物和重组载体酶切产物鉴定（略） 可溶性单链抗体结合外周血单核细胞（PBC）和淋巴母细胞性白血病细胞 （MOLT4），但不结合黑色素瘤细胞（A375）和人宫颈癌细胞（Hela）. 图2 ELISA 检测单链抗体免疫活性（略） 2 讨论 单链抗体被认为是具有抗原结合