外源赤霉素对拟南芥种子含油量和脂肪酸组分影响及分子机制初探.docVIP

外源赤霉素对拟南芥种子含油量和脂肪酸组分影响及分子机制初探 　　摘要:在拟南芥进入生殖生长时期,喷施1mM与50mM的外源赤霉素分别提高每g拟南芥种子含油量19.7mg与68.8mg,增幅分别达6.4%与22.2%。此外,喷洒赤霉素(特别是浓度为50mM的赤霉素)还引起亚油酸、亚麻酸组分比例的显著变化。对在种子中表达的、编码油酰去饱和酶的FAD3与FAD8两基因的转录水平分析表明,外源赤霉素上调FAD3的表达达到2.5倍,而下调FAD8的表达超过9倍。这项研究结果对于运用赤霉素调控油料作物种子脂肪酸积累具有一定的参考意义。 　　关键词:拟南芥;赤霉素;含油量;脂肪酸 　　 　　中图分类号:S637.903 　　文献标识码:B 　　文章编号:1674-9944(2010)07-0177-02 　　 　　1 引言 　　拟南芥属十字花科植物,现已成为学者研究种子油脂形成的生物学机制的重要模式植物。油脂是种子的主要储存物质,在种子中,油脂的主要存在形式三酰甘油以三磷酸甘油和酰基辅酶A为前体在内质网上合成。拟南芥种子中的脂肪酸主要由棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)花生酸(C20∶0)、廿碳烯酸(C20∶1)和芥酸(C22∶1)等组成。脂肪酸内部双键的存在与否及其数量与位置的变化对油的物化特性和营养价值均有影响。研究拟南芥种子含油量和脂肪酸形成的分子机制对油菜等油料作物的育种实践具有一定的指导意义。 　　赤霉素是一种非常重要的植物激素,属于环行萜类化合物,最早被发现于水稻中。研究表明,赤霉素通过改变受体GID的构象来降解DELLA蛋白从而起调控作用。赤霉素几乎影响植物生长发育的各个方面,包括种子萌发,下胚轴伸长,茎秆生长,发育器官的发育和种子的形成。尽管赤霉素的作用机制已得到很好的证实,但是赤霉素对种子含油量和脂肪酸组分的影响目前还没有报道。因此,该研究通过外源喷施不同浓度的赤霉素以初步探讨外源赤霉素对种子脂肪酸组分的影响及其分子机制。 　　2 材料与方法 　　选择应用拟南芥“哥伦比亚”生态型作为这项研究的主要植物材料。温室盆栽试验采用单因素随机区组试验,赤霉素处理分0mM(对照)、10mM、50mM3个梯度,每处理3个重复。当植株进入现蕾期,开始喷施赤霉素,每隔1d喷1次。至荚果形成后,停止喷施赤霉素。实验室数据采用DPS软件进行方差分析。 　　大约在播种后40~43d,将处理与对照的拟南芥植株荚果采集在15mL试管中,荚果离体之后立即冻存于液态氮,并随后保存在-80°冰箱,用于RNA的提取,大约播种后45d,将相同处理的植物荚果分别按照不同的重复组收获,晒干后放入在1.5mL试管,用于脂肪酸组分与含油量测定分析。使用日本岛津公司生产的GC-2014气相色谱仪分析拟南芥种子脂肪酸组分与脂肪酸总含量(含油量)。 　　基于初步试验结果,赤霉素对于种子不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比具有显著影响的事实,选择编码油酰去饱和酶基因FAD3作为研究对象。在国际拟南芥网站获得FAD3基因的全基因序列,采用DNA-STAR软件绘制基因外显子、内含子、起始密码子、终止密码子、5’端与3’端的非翻译区、常用限制性内切酶位点等结构特征,并依据跨内含子的原则确定Real-Time PCR的引物位置。用于扩增FAD3(At2G29980)的引物序列为:5’-3’ CAGTACTCGGATGCTCAGATAC/AGCTTTCTCT CGCTTGGAGCAA。看家基因ACTIN7作为对照基因,用于扩增actin7的引物序列为5’-3’为GCCCCTGAGGAGCACCCAGTT/CCGGTTGTACGACCACTGGCA。 　　3 结果与分析 　　3.1 对种子含油量的变化 　　试验结果显示,赤霉素对拟南芥种子的含油量(即脂肪酸总量)具有显著的影响。未喷赤霉素的对照每克种子含油脂310mg,喷施1mM赤霉素的拟南芥种子每克含油脂329.7mg,比对照增加6.35%,而喷施50mM的拟南芥种子每克含油脂378.8mg,比对照增加22.19%。统计分析表明,三者之间的差别均达到显著(?P?≤ 0.05)水平。 　　3.2对脂肪酸组分的影响 　　除了花生酸(C20_0)之外,其他各类主要脂肪酸棕榈酸(C16_0)、硬脂酸(C18_0)、油酸(C18_1)、亚油酸(C18_2)、亚麻酸(C18_3)、贡多酸(C20_1)、芥酸(C22_1)的组分均受到喷施外源赤霉素的影响。其中硬脂酸(C18_0)、亚油酸(C18_2)、亚麻酸(C18_3)的比例不受喷施1mM赤霉素的影响,只受到高剂量赤霉素(即50mM)的影响;而1mM与50mM浓度差别没有造成棕榈酸(C16_0)