毕赤酵母异源表达玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶及其酶学特性与功能的研究-heterologous expression of β - 1,4 - glucanase from zea mays by pichia pastoris and its enzymatic characteristics and functions.docxVIP

毕赤酵母异源表达玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶及其酶学特性与功能的研究 摘要玉 蜀 黍 赤 霉 菌 (Gibberella zeae) ， 以 它 的 无 性 型 孢 子 禾 谷 镰 刀 菌 (Fusarium graminearum)而著名，它是一种植物病原菌，能够引起大规模毁灭性的作物疾病， 如小麦、大麦的赤霉病和玉米的穗腐病等。在感染赤霉病的小麦和感染穗腐病的 玉米细胞内，赤霉病原菌可以产生两种霉菌毒素，引起消化道反应、肝损伤和家 畜生殖缺陷，严重危害人类健康。在菌丝体渗透过程中，赤霉菌体会产生细胞壁 溶解酶，其中包括β-葡聚糖。人们认为，β-葡聚糖酶作为一种细胞壁修饰酶能够 很好地分解β-葡聚糖和其他多糖组分，使其更容易降解，开始得到人类的广泛关 注。内切-β-1,4-葡聚糖酶在纤维素的水解过程中起着非常关键的作用，它能够作 用于纤维素链内的β-1,4 糖苷键，将长链纤维素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚 合物。在原核生物和真核生物中，纤维素酶已经形成一个大的家族体系并表现出 不同的特性。在本实验中，根据 NCBI 数据库公布的玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶 的基因序列（Genbank 编号为 ESU17701），根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行结 构优化，通过 PTDS 方法合成了适合于在甲醇毕赤酵母系统内表达的玉蜀黍赤霉 菌β-1,4-葡聚糖酶(GzeglAI)基因，并将载有目的基因的酵母表达载体 YR1730，电 击转化入甲醇型毕赤酵母 GS115 菌株体内进行分泌表达，通过后期的活性鉴定、 SDS电泳等方法，获得能够表达玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的阳性酵母菌 株。将获得的阳性毕赤酵母重组菌株进行扩大培养和诱导表达，获得重组β-1,4- 葡聚糖酶，粗酶液经镍柱纯化后，进行相关酶学特性和动力学参数等的实验研究。 结果表明：GzeglAI 的相对分子大小为 27.17 kDa，蛋白定量为 12.37 μg/mL，等 电点为 7.75。酶的最适温度是 40oC，最适 pH 为 4.5；当把酶 GzeglAI 置于 4oC，24 h 处理后，其在酸性 pH 下表现出一定的稳定性，特别是在 pH 4.0-6.5 的活性高于 80 %；研究温度稳定性时，把酶液在不同温度下处理不同时间显示，在 50oC 时处理半小时可保持初始酶活的 30 %，而当温度达到 60oC 时酶活急速下降，最 终完全失活为零，所以此酶的热稳定性较差，并不耐高温；本实验还探究了高低（1 mM 和 10 mM）两种浓度的不同金属离子对酶活性的影响，研究发现低浓度 的 Mn2+、高浓度的 Mn2+和 Cu2+对酶活有抑制作用，Cu2+抑制力较强，而高浓度 的 Al3+却极大程度地促进了该酶活反应；选取羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、脱脂棉、 滤纸和结晶纤维素( 6 %)等不同纤维素类物质进行底物特异性的反应研究，结果 显示该酶对底物羧甲基纤维素钠有较强的专一性，其 Km 值为 73.92 g/L, Vm 值 为 0.16 g / ( L.min )；同时也研究了两种蛋白消化酶如胃蛋白酶(pepsin)和胰蛋白酶 (trypsin)对 GzeglAI 活性的影响，结果显示胃蛋白酶对酶活性有一定程度的抑制作 用，相反地，胰蛋白酶却对酶促反应无任何研究影响。根据 SWISS-MODEL 网站 的 PDB 数据库资源比对分析，选取 4h7m.1.A（ThEG3）为模板进行同源性建模， 两者相似度高达 58.72 %；同时发现，此β-1,4-葡聚糖酶属于糖基水解酶第 12 家族 中，其三个催化残基 Asp120、Glu137 和 Glu221 在进化中是严格保守的。鉴于目前缺乏玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶的相关报道，本实验通过毕赤酵母 分泌表达玉蜀黍赤霉菌的β-1,4-葡聚糖酶基因，研究该β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质 与功能，不仅为阐述β-1,4-葡聚糖酶在玉蜀黍赤霉菌发育进程及致病机理中所起的 作用提供理论依据，并且为玉蜀黍赤霉菌β-1,4-葡聚糖酶高效工程菌株的构建和工 业化生产提供了一种潜在的应用选择。关键词 β-葡聚糖酶；玉蜀黍赤霉菌；毕赤酵母；酶学性质；DNS 法Characterizations and Funtional Analysis of β-1,4-glucanase from Gibberella zeae Expressed in Pichia pastosisAbstractGibberella zeae, known by its anamorph Fusarium graminearum, is a plant pathogen. They can cause the most devastating disease,