切除眼柄对凡纳滨对虾litopenaeus vannamei差异表达基因的影响及几种重要基因在不同卵黄发生阶段的表达量变化-effects of eyestalk removal on differential expression genes of litopenaeus van namei in litopenaeus vannamei and changes of expression levels of several import.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 答辩地点 答辩时间 3 切除眼柄对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)差异表达基因的影 响及几种重要基因在不同卵黄发生阶段的表达量变化 摘 要 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国主要养殖虾类之一。本实 验利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了卵巢和肝胰腺在卵原细胞增 殖期（第一期，切除眼柄前）与初级卵黄发生期（第三期，切除眼柄 后）差异表达基因的文库。通过单克隆进行测序，测序结果与 GenBank 进行 BLASTx 与 nucleotide BLAST 进行同源性分析，利用 NCBI 数据 库进行差异表达基因功能的注释，选取部分有代表性的差异表达基因 进行荧光定量 PCR，研究差异表达基因在卵巢和肝胰腺各个发育时期 的表达情况。分析这些差异表达的基因与卵黄发生之间的关系。并且 通过荧光定量 PCR 技术，专门研究了在不同卵黄发生阶段，主要差异 表达基因以及卵黄蛋白原和血蓝蛋白在卵巢与肝胰腺中表达量变化， 并分析它们与卵黄发生作用的关系。 研究结果表明，卵巢第一期差异表达基因为：极孔样蛋白、肌动蛋 白、血小板反应蛋、及核自身抗原精子蛋白基因。卵巢第三期差异表 达基因分别是；脂肪酸结合蛋白、二硫键异构酶、转醛醇酶、及血蓝 蛋白基因。肝胰腺第一期差异表达基因是：ATP 亚基、NADH 亚基和 铁蛋白基因。第三期差异表达基因有两个，分别是血蓝蛋白和卵黄蛋 白原基因。 4 极孔样蛋白和卵黄蛋白基因在卵巢第一期和第三期均有表达，前者 在第一期表达强烈，后者则在第三期有旺盛表达。基因表达状况与第 一期卵母细胞分裂和第三期卵黄合成的生理活动密切相关。 荧光定量 PCR 结果表明，极孔样蛋白（PH）、核自身抗精原蛋白 (NA)、和血小板蛋白(THP)基因主要在卵巢表达。而且在切除眼柄前， 这些基因的表达量都最高，随着卵巢发育，其表达量逐步下降，在第 四-五期达到最低，其后稍有增加。PH、NA 等基因的主要功能是信号 传导和调控细胞分裂，因此卵巢发育前期，他们的表达相对较高，与 卵巢发育的生理活动是紧密关联的。 利用荧光定量 PCR 技术分别检测了血蓝蛋白与卵黄蛋白原 mRNA 在卵巢和肝胰腺不同发育时期的表达量。结果显示，血蓝蛋白 mRNA 主要在肝胰腺中表达，随着卵巢的发育，表达量呈增加趋势，至第三 期达到高峰，其后稍有下降，但仍然维持在较高水平，在第六期降低 到初始水平。而卵黄蛋白原 mRNA 的表达量随着卵巢发育持续增加， 在第五期达到最高，在恢复期才迅速下降。研究结果显示，血蓝蛋白 的合成与卵巢发育呈现一定的相关性，血蓝蛋白是否直接或间接参与 了卵黄发生和卵巢发育值得进一步探讨研究。 关键词：凡纳滨对虾、眼柄切除、卵巢、肝胰腺、抑制性消减杂交、 卵黄蛋白原、血蓝蛋白、差异表达基因 5 Effect of eyestalk- ablation on differential expressed genes and profile of the important genes during ovarian development stages of shrimp Litopenaeus vannamei Litopenaeus vannamei also known as P. vannamei, is a majoy aquaculture species in China. In the present study, by using suppression subtractive hybridization (SSH) we build library of different expression genes between oogonia proliferating ( first phase ,before eyestalk-ablation ) and primary vitellogenesis ( third phase , after eyestalk-ablation ) in ovary and hepatopancreas. The sequencing results were compared by BLASTx and nucleotide BLAST homology on GenBank, and analysis by NCBI database for differential expressed gene function annotation. Selectting several different express