四种天然异种骨移植材料bcbb bcbbbmp bcbbbfgf bcbbbmpbfgf的体内细胞免疫学研究-study on cellular immunology of four natural xenograft materials bcbb bcbbbmp bcbbbfgf bcbbbmpbfgf in vivo.docxVIP

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2018-07-31 发布于上海
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四种天然异种骨移植材料bcbb bcbbbmp bcbbbfgf bcbbbmpbfgf的体内细胞免疫学研究-study on cellular immunology of four natural xenograft materials bcbb bcbbbmp bcbbbfgf bcbbbmpbfgf in vivo.docx

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四种天然异种骨移植材料bcbb bcbbbmp bcbbbfgf bcbbbmpbfgf的体内细胞免疫学研究-study on cellular immunology of four natural xenograft materials bcbb bcbbbmp bcbbbfgf bcbbbmpbfgf in vivo

1．前言临床上因创伤、感染和肿瘤切除造成的骨缺损十分常见，虽然自体骨是较常使用的骨移植材料，但供骨来源有限，且易造成二次手术痛苦和并发症；异种骨移植则存在免疫排异反应，并可能导致某些疾病的传播和肿瘤的生成。因此研制理想的骨移植替代材料是医学界的迫切要求[1]。自19世纪以后，随着组织工程学的兴起和发展，人们开始用组织工程的原理和技术对骨缺损进行修复。而骨组织工程的研究主要集中在支架材料、种子细胞、生长因子、组织器官的构建等方面[2]理想的骨组织工程支架材料应具有良好的生物组织相容性、骨传导性、骨诱导性、生物降解性和一定机械强度[3]。以往的支架材料（包括人工合成材料和天然生物衍生材料）难于同时具备以上优点[4]。目前已有复合有骨生长因子的支架作为骨移植材料应用于临床，但组织相容性相对不理想[5]，在众多生长因子中，骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）和碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）是近来研究得较深入的两种骨生长因子[6]。BMP能够诱导未分化骨髓基质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）向软骨母细胞和骨母细胞分化[7]，其在骨组织再生修复中的作用已得到公认，并已应用于临床，而bFGF对已分化的MSCs具有促增殖作用，而且是一强大的血管生长因子[8]，二者具有协同作用。但是同时复合有BMP和bFGF因子的骨移植材料目前并不多。本研究所用的双相陶瓷生物骨（BiphasicCeramicBiologicBone，BCBB）采用猪椎骨为原材料，因猪骨具有来源广泛、取材方便、解剖结构与人类相似、有机和无机成分与人类接近、猪与人MHC-DR基因同原性高的特点[9]，所以我们采用猪椎骨为原材料借鉴和完善前人制备煅烧骨的方法，通过低温煅烧，制备陶瓷化骨（Trueboneceramic，TBC）。TBC具有天然孔隙结构，其主要成分是羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）。HA属于缓慢吸收性陶瓷，但生物降解性能差，因此常需要改性或与其他材料复合以加速其吸收[10]。采用两次锻烧和加入焦磷酸钠溶液（Na4P2O7?10H2O，NP）的方法可将HA完全或部分转化成磷酸三钙（Tricalciumphosphate，TCP），通过调整锻烧参数可以控制HA的转化率[11]。该实验制备以HA和TCP为主要成分的双相陶瓷生物骨（BiphasicCeramicBiologicBone，BCBB）。以BCBB为支架材料，先用Ⅰ型胶原修饰其表面[12-14]，然后将适当浓度的BMP溶液和bFGF溶液混合（每块骨粒含BMP12.5mg,bFGF2000IU），电磁震荡器震荡，负压抽吸，冻干,分别制成四种新型骨移植材料BCBB、BCBB/BMP、BCBB/bFGF、BCBB/BMP/bFGF。骨移植材料的组织细胞相容性是材料能否应用于临床的重要因素[15]，T淋巴细胞是介导细胞免疫的关键细胞，根据其表面抗原决定簇分化的不同，可将T淋巴细胞分为辅助性T淋巴细胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制性/细胞毒性T淋巴细胞（CD3+CD4-CD8+）等两个亚群，各亚群淋巴细胞在免疫系统中相互协作，相互制约，维持免疫系统的正常功能[16]。许多研究表明CD4+和CD8+两个亚群皆参与异种移植时的免疫排斥反应[17-18]，CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值的变化可反映器官移植后引起的排斥反应[19]。临床上常通过流式细胞技术观察CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值的变化来监测免疫排斥反应[20]。本实验是将所制得的四种天然异种骨移植材料BCBB、BCBB/BMP、BCBB/bFGF、BCBB/BMP/bFGF、分别植入不同组兔股部肌袋内。通过术后1、2、3、4、6、8周不同时期抽外周静脉血，流式细胞仪动态检测CD4+、CD8+和CD4+/CD8+比值的变化，并取材进行大体标本观察、组织学观察，为进一步了解四种骨移植材料BCBB、BCBB/BMP、BCBB/bFGF、BCBB/BMP/bFGF的细胞免疫原性，为该四种骨移植材料BCBB、BCBB/BMP、BCBB/bFGF、BCBB/BMP/bFGF的临床应用提供理论依据。2.1药品、试剂、仪器2.1.1实验用药品及试剂2．材料与方法名称产地鼠抗兔CD4-PE/CD3-FITC荧光标记抗体检测试剂盒美国ANTIGENIXAMERICA公司鼠抗兔CD8-PE/CD3-FITC荧光标记抗体检测试剂盒美国ANTIGENIXAMERICA公司红细胞裂解液美国BD公司速眠新Ⅱ号注射液军事医学科学院军事兽医研究所苏3号注射液军事医学科学院军事兽医研究所聚维酮碘消毒液武汉西优消毒药业有限公司75%医用酒精贵