ADSCbFGF对大鼠背部带蒂皮瓣存活率实验研究.doc

ADSCbFGF对大鼠背部带蒂皮瓣存活率实验研究 　　[摘要]目的：脂肪来源间充质干细胞复合碱性成纤维细胞生长因子（ADSC-bFGF）对大鼠背部带蒂皮瓣模型存活率的影响。方法：获得SD大鼠腹股沟脂肪，经体外分离、培养并进行多功能分化潜能的鉴定。MTT法检测bFGF培养液对ADSC的影响。建立大鼠背部自身对照带蒂皮瓣模型。应用CM-DiI荧光染料标记ADSC。在皮瓣可预测坏死区域分别给予A1组bFGF、A2组ADSC、A3组bFGF-ADSC、B组生理盐水。全部动物于术后7天测量皮瓣成活面积、HE染色、冰冻切片的CD31荧光显影，统计学分析ADSC-bFGF促进皮瓣成活的作用。结果：bFGF有明显促ADSC增殖作用，增值最快的最低浓度为5μg/L。A3组皮瓣成活率、毛细血管增生均显著高于其它组。结论：bFGF可促ADSC增值，具有协同作用。ADSC-bFGF可高效的刺激大鼠背部自身对照带蒂皮瓣的血管新生，显著的提高皮瓣的成活率。 　　[关键词]脂肪来源间充质干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；大鼠背部带蒂皮瓣 　　[中图分类号]R622 R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）08-0829-04 　　提高皮瓣的成活率，促进皮肤创伤修复是目前临床工作需要解决的关键问题，因此研究寻求有效的方法预防术后皮瓣的缺血坏死具有重要的理论和临床实际意义。使用各种不同的动物皮瓣模型往往会导致难以解释的实验结果。本研究采用可预测皮瓣坏死面积的带蒂皮瓣模型，并改进形成自身对照皮瓣。目的是通过使用ADSC-bFGF局部注射，刺激大鼠实验组皮瓣模型的血管新生，从而增加皮瓣的成活率。 　　1 材料 　　1.1 设计：采取随机，对照，动物实验。 　　1.2 实验材料：健康纯种雄性SD大鼠，质量为400～500g，21只，250～280g，10只。（哈尔滨医科大学动物实验中心提供）。DMEM-F12培养基、胎牛血清（美国Sigma公司），油红O（美国Sigma公司）；2%茜红素染液（美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT）检测试剂盒（ 武汉博士德） ，二甲基亚砜（美国Sigma公司），CM-DiI（美国Molecular Probe公司），小鼠抗大鼠CD31抗体美国Abcam公司）；贝复济（珠海亿胜生物制药有限公司）山羊抗小鼠IgG-FITC（中杉金桥）；酶标仪（日本Reader仪器公司） 　　2 方法 　　2.1 脂肪来源间充质干细胞 （Adipose derived stromal cell，ADSC）的体外分离、纯化、扩增培养：取250～280g雄性SD大鼠，无菌条件下采集双侧腹股沟脂肪，0.1%Ⅰ型胶原酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM-F12终止，离心重悬，以3×104个/cm2接种于25cm2塑料培养瓶，置于 37℃，5% C02的孵箱内培养，72h换液，弃掉未贴壁细胞，每3天换液1次。通过多次传代获取纯化的ADSC。 　　2.2 ADSC分化能力的鉴定：向培养ADSC的6孔板加入成骨、成脂诱导液，4周后进行茜素红染色、油红O染色检测。 　　2.3 bFGF对ADSC增值影响：取第5代ADSC接种于96孔板，细胞贴壁后每孔按0、2.5、5、10、50、100μg/L浓度加入bFGF培养液200μl，每个浓度3孔；48h后检测，加5 g/L的MTT 溶液20μl，37℃孵育4 h，弃孔内液体，再加二甲基亚砜150μl低速震荡10min，用酶联免疫检测仪测A490值，并记录结果。重复3次实验。 　　2.4 DiI荧光标记ADSC：注射细胞之前，取第5代细胞用无血清培养液制成2×106/ml的细胞悬液1ml，加2μg/ml DiI染液，37℃孵育30min，离心重悬后，倾去染液，加PBS溶液制成1ml细胞悬液，孵箱孵育5min后移入4℃冰箱备用。 　　2.5 实验分组及治疗：实验动物21只，每只分为左侧实验组A组（随机分成A1、2A、A3）、右侧对照组B组。A 1组：注射bFGF；A2组：注射ADSC；A3组：注射ADSC+ bFGF；B组：注射生理盐水。 　　2.6 大鼠背部自身对照带蒂皮瓣模型的建立：健康纯种雄性SD大鼠，400～500g，水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉（3ml/kg），自身对照皮瓣模型设计成两个等大矩形，大小3cm×8cm。消毒铺巾，沿设计切口线切开皮肤至深筋膜层，沿头尾方向掀起皮瓣，离断全部穿支血管，仅保留两侧旋髂深动脉为蒂，彻底止血。取经标记的ADSC，对A1、A2、A3、B组分别注射bFGF、ADSC、ADSC-bFGF悬液、生理盐水，注射范围是皮瓣头侧上1/3，每点均为0.1ml，总量为1ml/只，原位缝合切口。术后7天观察皮瓣 （图1）。 　　2.7 皮瓣坏死