PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织修复大鼠坐骨神经缺损实验研究.docVIP

PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织修复大鼠坐骨神经缺损实验研究 　　[摘要]目的：探讨PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑修复大鼠坐骨神经缺损的修复效果。方法：32只SD大鼠平均分成4组，无菌条件下切断右侧的坐骨神经，制成10mm长的大鼠坐骨神经缺损模型，A组采用PLGA神经导管连接缺损神经进行修复，B组由内置自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接，C组由内置ADSCs与自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接，D组采用自体神经移植方式。12周后通过对再生神经桥接体的一般观察、HE染色、免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色来评价神经的再生情况；通过肌电图、腓肠肌的HE和Masson染色来评价神经对靶器官的再支配情况。结果：术后12周，各组的神经导管均已降解，切断神经通过神经导管向两端生长。一般观察、肌电图、组织学观察结果均提示PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑组C组的修复效果显著优于内置神经组织碎屑的PLGA神经导管组B组和空导管组A组的修复效果，但仍稍差于自体神经移植组D组。结论：PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织可以比较有效地修复周围神经缺损，为周围神经缺损的修复提供了一种新的方法。 　　[关键词]周围神经缺损；神经组织碎屑；脂肪干细胞；聚乳酸羟基乙酸；神经导管 　　[中图分类号]R745 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0060-06 　　周围神经缺损是临床上常见的疾病，外伤、手术操作、肿瘤切除等均会导致周围神经缺损的发生，对于普通的神经离断损伤可以在无张力的条件下用端端吻合的方法修复。而对于较长节段神经缺损的修复，目前的金标准是自体神经移植，但是自体神经移植具有供区来源有限、二次损伤、供区的感觉功能障碍、供区和受区神经结构和粗细不匹配等缺点。鉴于自体神经移植的诸多限制，组织工程神经导管应运而生，人们早期曾使用空腔静脉导管修复周围神经缺损，后来有学者采用在静脉内填充神经碎屑来修复周围神经缺损，均取得了比较好的修复效果。近年来聚乳酸羟基乙酸（poly-lactic-co-glycolic-acid，PLGA）神经导管以其优越的性能受到学者们的重视且已被广泛应用于各研究中，其性能也得到进一步完善，如对导管进行甲壳素涂层来改善导管的生物学性能；在导管内置入纤维丝改善神经导管的内部空间结构等。有研究发现PLGA材料复合雪旺细胞、细胞生长因子、间充质干细胞或脂肪干细胞（adipose derived stem ceils，ADSCs）后能促进轴突的再生和髓鞘的形成以及神经功能的恢复。本实验设计以PLGA神经导管为支架材料，将自体来源的神经碎屑，复合ADSCs填充到神经导管中，探讨此种联合自体神经组织和ADSCs的具有内部空间结构的神经导管修复周围神经缺损的效果。 　　1材料和方法 　　1.1材料与设备：健康成年SD大鼠32只，雌性，体重200～250g（上海斯莱克动物实验有限公司）；5～7d SD乳鼠若干只，体重（16.0±2.1）g（上海斯莱克动物实验有限公司）。 　　DMEM培养基（Hyclone）、复合胶原酶NB4（Serva，Germany）、胎牛血清（Hyclone，Australia）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、0.2 5%trypsin-EDTA（Gibco，Canada）、兔抗单克隆neurofilament-H（Millipore，USA）、兔抗S100单克隆抗体（Dako，Denmark）、驴抗兔IgG抗体（Invitrogen，USA）、Masson染色试剂盒（Leagene）、Calcein-AM（上海麦约尔生物技术有限公司）、甲苯胺蓝。PLGA导管材料由东华大学提供。 　　倒置相差显微镜（Olympus，Japan）、恒温CO2培养箱（Forma Scientific，USA）离心机（Thermo，USA）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）、正置显微镜（Nikon 90i，Japan）、Evos显微镜（Life，USA）、荧光显微镜（Nikon，Japan）、冰冻切片机（Shandon Cryotome FSE，Thermo scientific，British）、Key point多道肌电图仪（Dantec，丹麦）、石蜡切片机（Shandon Finesse 325，Thermo Shandon Ltd.，British）、解剖显微镜（Motic，USA）、显微外科手术器械（上海手术器械厂，中国）。 　　1.2实验方法 　　1.2.1 PLGA神经导管的准备：取PLGA神经导管，环氧乙烷消毒，真空包装备用。 　　1.2.2 ADSCs的取材、培养、观察和鉴定：将5～7d SD乳鼠颈椎脱臼处