地高辛标记对旱稻进行southern杂交分析主要影响因素优化和验证.docVIP

地高辛标记对旱稻进行southern杂交分析主要影响因素优化和验证 　　摘要：以转基因旱稻和野生型旱稻为材料，对通过地高辛随机引物标记法进行的旱稻基因组Southern杂交条件进行了优化分析，包括探针制备效率、DNA样品量、酶切体系及转膜时间等。结果表明：影响探针制备效率的首要因素是温度而不是时间；DNA上样量在10～30 μg均可以获得高质量的杂交图；60 μL体系15 h即可酶切彻底并获得良好的杂交效果；转膜时间6 h即可。本研究所优化的地高辛标记的旱稻杂交分析结果稳定重复性好，具有较高的灵敏度和信噪比。 　　关键词：旱稻；地高辛；Southern杂交方法；优化；验证 　　中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0041-03 　　Southern blotting 技术于1975年由英国科学家Southern创立，随着该技术的不断发展与普及，目前已成为分析基因结构和检测特定DNA片段的经典技术方法之一[1]。该技术能够在DNA水平检测外源目的基因是否已经转入并成功整合到植物的染色体上，同时对外源片段的拷贝数目进行分析。目前，Southern杂交中标记探针的方法有同位素和非同位素2种。使用同位素标记是最经典的方法，其灵敏度高，能检测出极其微量的信号源，但对试验的条件有比较严格的要求，且会对环境以及实验者的身体造成放射性辐射危害。非同位素标记又分为生物素标记和地高辛标记。由于生物体中并没有地高辛，所以相比于生物素而言，地高辛可以更好地消除内源性背景，应用前景也更为广阔[2]。据报道，棉花[3]、烟草[4]、小麦[5]、油菜[6]、甘蔗[7]、橡胶树[8]、热带果树[9]等植物用地高辛标记的杂交技术均可获得良好的杂交效果。 　　目前，虽然有地高辛标记探针试剂盒大大方便了试验，但是试剂盒说明书更多地侧重于步骤流程的描述，至于一些技术要点、操作细节、实验注意事项的介绍并不很多。这也直接导致许多试验没能得到满意的结果。本研究以8个不同的LEA家族抗逆旱稻品种为材料，参考前人成功经验，结合本实验室的实际情况，对地高辛标记探针的Southern?s交方法进行探索改进和优化，取得了理想效果，现作一总结。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　转基因的T3代旱稻由本实验室通过农杆菌侵染法获得。 　　1.2试验方法 　　1.2.1探针标记反应管中加1 μg纯化的目的基因DNA片段，加ddH2O至终体积16 μL。沸水浴10 min变性，迅速插入冰水混合物中，取混匀的地高辛高效引物4 μL到变性的DNA中，混匀，37 ℃孵育20 h。加入2 μL 0.2 mol/L EDTA（pH值8.0）或65 ℃加热10 min终止反应。 　　1.2.2旱稻基因组DNA的提取及纯化采用改良的CTAB[10]法对旱稻基因组进行提取，略加改动。65 ℃预热 15 mL 提取缓冲液[CTAB 30 mg/mL，NaCl 1.4 mol/L，EDTA（pH值8.0）20 mmol/L，Tris-HCl（pH值8.0）100 mmol/L，β-巯基乙醇0.2%（V/V）]；液氮研磨2.5 g植物叶片成粉末后刮入离心管的提取缓冲液中，65 ℃保温40～60 min，每 10 min 轻取出轻摇混匀；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，静置15 min，12 000 r/min离心15 min；转移上清至一新的Eppendorf管，加等体积的氯仿/异戊醇，混匀10 min，静置10 min，12 000 r/min离心10 min；将上清液转移到新的离心管中，加1倍体积的异丙醇，混匀；-20 ℃放置1 h或过夜，将絮状沉淀转移至一新的离心管中，70%乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，吹干溶解；加入适量RNase对样品进行消化，之后分别用酚/氯仿/异戊醇以及氯仿/异戊醇抽提1次，乙醇洗涤沉淀，超净台上吹干，溶于适量TE。用分光光度计测定样品DNA浓度以及D260 nm/D280 nm比值。 　　1.2.3样品酶切60 μL酶切体系中含30 μg纯化的旱稻DNA，250U限制性内切酶（Thermo），6 μL 10×buffer，补ddH2O至终体积60 μL。酶切15 h后取2 μL电泳，观察旱稻基因组是否酶切彻底。 　　1.2.4转膜及固定酶切充分的DNA加loading buffer混匀，80 V电泳约4 h，直至溴酚蓝位于凝胶的2/3处。电泳结束后凝胶不做脱嘌呤处理，经NaOH碱变性后参照分子克隆采用毛细管虹吸印迹法转膜，注意为了分清膜的正反面，要在尼龙膜的一角提前做好标记。将转膜之后的琼脂糖凝胶进行检测，若无核酸残留，证明转膜成功。将尼龙膜80 ℃烘烤2 h进行核酸的固定。 　　1.2.