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基于代谢组学方法小儿肺炎易感性研究 　　摘 要 以6个月到6岁肺炎患儿尿液为样本，采用基于气相色谱与质谱联用技术（GCMS）的代谢组学方法，研究肺炎患儿尿液内源性代谢产物的变化及其易感性的发病机制。收集不同感染次数的肺炎患儿尿液样本，包括正常儿童组29例、 单次感染肺炎患儿组35 例、 多次感染肺炎患儿组31例，分析获得肺炎患儿尿液代谢轮廓； 同时对所得数据进行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判别分析（PLSDA）等多元统计分析，综合单因素方差分析及倍数（Fold change，FC）变化分析结果，最终筛选并通过FiehnLib等数据库鉴定丝氨酸、 组氨酸、 脯氨酸、 正亮氨酸、 谷氨酰胺、 硬脂酸、 缬氨酸和异亮氨酸、 乳糖醛酸等在正常儿童组与肺炎患儿组之间有代谢差异（p value adjusted by FDR5，吲哚3乙酸、 肌酸、 乙醇胺、 甘露糖基甘油酸和果糖在不同感染次数肺炎组之间具有差异性（p value adjusted by FDR0.05）。实验结果表明，肺炎患儿易感性体质存在差异性代谢物，这些代谢物主要通过氨基酸及糖代谢对肺炎易感性产生影响。 　　关键词 小儿肺炎； 易感性； 代谢组学； 气相色谱质谱联用 　　1 引 言 　　肺炎是儿科常见病。世界卫生组织（WHO）将小儿肺炎列为全球3种重要儿科疾病之一，肺炎死亡数占全世界各种原因死亡总数的5%[1]，每年全球大约有100万5岁以下的儿童死于小儿肺炎，是发展中国家5 岁以下小儿死亡的主要原因[2]，故加强对肺炎的防治十分重要。 　　随着系统生物医学思维模式的建立，现代医学的研究正由微观、 实体的探索向宏观、 系统的角度转变，现代研究融入当前系统生物学将是必然的趋势。代谢组学做为系统生物学的代表之一，运用高通量技术，如气相色谱与质谱联用技术（GCMS）、 液相色谱与质谱联用技术（LCMS）等，研究生命体代谢产物的变化规律，揭示机体代谢的本质[3，4]。近年来，尿液代谢组学的临床及实验研究越来越多，部分研究基于液相色谱质谱技术探讨疾病的尿液代谢特征谱，涉及嘧啶代谢、 氨基酸代谢、 嘌呤代谢等[5～9]，且尿液为非创伤性诊疗措施，尿样本采集难度较低，适用于成人及小儿临床疾病特征谱的探索。 　　近年来，已有对小儿肺炎分子水平上的代谢组学研究报道[10，11]。Lu等[12]研究发现H1N1流感病毒感染肺炎患者血清内多种代谢途径发生改变，以花生四烯酸代谢通路中的内源性物质改变最显著，也可能与一些内源性氧化还原物质如谷胱甘肽的代谢紊乱有关[13，14]。本研究采用GCMS技术，研究小儿肺炎的代谢特征，以小儿肺炎晨尿样本为例，从尿液代谢角度出发，探讨了小儿肺炎易感性的物质基础，研究并揭示基于代谢组学的小儿肺炎易感性体质的可能的生物学机制。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　配备AS 1310 自动进样器的Trace 1310 气相色谱和TSQ 8000 质谱仪、 TG5MS 气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、 Speed Vac 离心浓缩仪（Thermo公司）； Allegra 64R centrifuge 离心机（美国Beckman Coulter公司）； CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）。 　　1，213C肉蔻酸（1g）、 BSTFA （含1% TMCS，10 mL）、 C8～C40 烷烃系列标准品（1 mL）、 吡啶（100 mL）和甲氧胺盐（50 mg）均购于Sigma 公司。11种标准品包括组氨酸、 丝氨酸、 脯氨酸、 硬脂酸、 缬氨酸、 异亮氨酸、 赖氨酸、 苏氨酸、 谷氨酸、 次黄嘌呤、 肌酸（50～100 mg， Sigma 公司）。 　　2.2 样品采集与制备 　　2.2.1 肺炎诊断标准 参照《诸福棠实用儿科学》第8版制订肺炎诊断标准[2]，选择病例。（1）纳入标准 符合上述肺炎诊断标准的6月～6岁住院患儿及正常儿童。（2）排除标准 有明确先天/后天遗传代谢障碍疾病者。入选时有心力衰竭、 呼吸衰竭、 中毒性脑病、 渗出性胸膜炎等严重合并症者。合并有心脑血管、 肝肾和造血系统等严重原发性疾病及精神病患者。 　　2.2.2 样品采集 本研究经南京中医药大学附属医院（江苏省中医院）伦理委员会批准，纳入病例均获得患儿家属知情同意。选取2014年1～4月在首都医科大学附属北京儿童医院住院部确诊为肺炎的6月～6岁患儿及儿童保健科采集6月～6岁正常儿童的晨尿。 共纳入正常儿童（NC）组29例，单次感染肺炎（FIP）?M35例，多次感染肺炎（RIP）组31例，临床资料见表1。3组间儿童年龄、 性别、 身高、 体重无统计学差异（p0.05），而肺炎组的血常规（白细胞计数、 中性粒细胞