不同添加成分对冻融后人原始卵泡体外培养的研究-妇产科学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 不同添加成分对冻融后人原始卵泡体外培养的研究 研究生 赵红岩 导师 孙萤瑛 郑州大学第一附属医院生殖医学中心 中国郑州 450052 摘要 卵巢组织冷冻保存已经成为生痛医学领域研究的热点。冻融盾的卵巢组织 主要用于移植或体外培养。对于恶性肿瘤患者来说，自体移植显然是不合适的， 而异种移植又受到伦理以及动物源性传染病的限制。体外培养又分为卵巢组织 体外培养和卵泡体外培养。大量动物实验研究表明，卵巢组织体外培养可以保 存完整的卵炮结构以及卵泡与组织间的相互作用，成为探索新鲜成冻融卵巢组 织中卵泡生长发宵的囊要研究模型，但是，由于人卵巢皮质中卵泡的分而不均 匀，仅靠冷冻前的组织形态学分析很难估计冷冻组织块中的卵泡数囊，卵巢组织 块中卵泡含量的不确定性大大降低了卵巢组织体外培养的价值。分离后卵泡的 体外培养因能够为辅助生殖技术提供实实在在的卵母细胞来源而优于卵巢组织 体外培养。 目的 本研究采用直接覆盖玻璃化冷冻法冻存人类卵巢组织，解冻后分离卵泡， 完整存活卵泡行体外培养，使用藻酸钙作为王维培养体系，在体外培养液中添 加干细胞因子 st侃侃11 factor ，SCF，又称kit 配体)及白血病抑制因子 leukaemia inlùbitory fa创时，LI凹，以探讨体外培养条件下 LIF 与 SCF 对人原始卵泡生长发 宵的影响，研究最佳的体外培养条件。为构建人类卵子库提供基础研究。 方法 人卵巢组织冷冻方案基本参照 Chen 等川报道的直接覆盖玻璃化冷冻方案 (DCV)0 1.将所收集的 18例卵巢组织分割成 lmmx lmmx2mm 的组织块，随机留 2 3 块新鲜组织 10%中性甲醒固定，部分新鲜组织用于分离卵泡，其余组织全部用 于直接覆盖玻璃化冷冻保存: 2. 解冻后的卵巢组织随机留 2--3 块 10%中性甲醒固定，其余组织全部用 于分离卵泡: 3. 选取形态正常的卵泡随机分成 5 组，添加不同成分的培养液，在藻酸钙 王维培养体系中体外培养 8d? 隔天半最换液，收集培养液置于 -20.C 冰箱保存， 采用电化学发光免疫分析法( electrochemilumines 四nceimmunoωsay ，CL队)测定 雌二醇水平 :ω、、8d 测卵泡直径:台盼蓝染色评价卵泡活率。 4. 采用 SPSS13.0 统计学软件对实验数据进行统计学分析。 结果 1.卵巢组织冷冻前后组问各级卵泡构成比例差异无统计学意义 (P0.05)， 组内各级卵泡构成比例差异有统计学意义 (P0.05)，人卵巢组织中的卵泡主要 为原始卵泡，其次为初级卵炮和次级卵泊，未见窦状卵泡，且卵泡在组织中的 分布不均匀: 2. 冷冻前后原始卵池中异常卵泊所占比例无统计学差异 (P0.05)。各组内 原始卵泡与初、次级卵泊相比，蒙异有统计学意义 (P0.05)，冷冻后初、次级 卵泡的损伤程度较;今冻前增加，但差异无统计学意义 (PO.05); 3. 冷冻前后分离的卵泡绝大部分存活，冷冻过程对分离的各级卵泡的存活 率比较差异无统计学意义 (PO.05)，但初、次级卵泡存活率较原始卵泡存活率 偏低: 4. 随着培养天数的增加，对照组卵泡直径增长缓慢，明显小于各实验组 (p 日 摘要 摘要 0.05) ;而在实验组中， SCF 和 LIF 联合培养组中卵泡直径增长迅速，较单独 培养组差异有统计学意义(户 0.0日，联合培养组中，不同浓度的 SCF 组中卵泡 直径的增长速度相差不大，差异无统计学意义 (P0.05); 单独 SCF 和 LIF 组相 比，卵泡生长速度差异无统计学意义 (P0.05); 5. 随着培拌天数的增加，各组卵泡都具有分秘激素的功能。 4 天后对照组 卵泡激素水平增长缓慢，明显小于各实验组 (P0.05)，而在实验组中， SCF 和 LIF 联合培养组中卵泡激素分泌增长迅速，较单独培养组差异有统计学意义 (p 0.05) ，联合培养组中，不同浓度的SCF 组中卵泡的激素增长速度相差不大， 但在第 4 天差异有统计学意义 (P0.05); 单独 SCF 和 LIF 组相比，卵泡激素水 平差异无统计学意义 (P0.05); 6. 体外培养 8d 后，采用台盼蓝染色评价各组卵泡的存活率，对照组的卵 泡存活率明显低于实验组 (pO.OS)t 而备实验组相比卵泡存活率无明显差异 (p 0.05) 。 结论 1.直接覆盖玻璃化冷冻法操作简单，耗时姬，能够很好的保存人卵巢组织 ? 中的卵泡，可用于人类卵巢组织的冷冻保存: 2. 冷冻过程对原始卵泡无明显损伤，但对初、次级卵泡可造成一定程度的 损伤: 3. 藻酸钙能够维持卵泡的完整结构，维持细胞间的缝隙连接，可以作为三 维培养体系