枯草芽孢杆菌ge25菌株发酵及其抑菌活性成分初步研究.docVIP

枯草芽孢杆菌ge25菌株发酵及其抑菌活性成分初步研究 　　[摘要]人参是我国传统名贵中药材，病害问题严重影响人参的产量和品质。在前期分离到对多种人参致病菌有理想抑菌活性的内生枯草芽孢杆菌ge25菌株基础上，研究采用盐析和酸沉淀法从LB和Landy发酵液中制备蛋白粗提物和脂肽粗提物，用人参黑斑病菌检测粗提物的抑菌活性及其对高温和蛋白酶消解的稳定性；研究发现，LB发酵物中的抑菌成分主要是蛋白类物质，不耐高温和蛋白酶K；Landy发酵物中的抑菌成分主要是脂肽类物质，其对高温和蛋白酶K稳定。原位酸水解-茚三酮显色和TLC-生物自显影分析发现，脂肽粗提物中至少含有1种抗菌环肽。鉴于源自ge25菌株的脂肽类物质的高稳定性及理想的抑菌活性，对其开展深入研究将有助于推动人参病害的生物防治。 　　[关键词]人参；内生菌；枯草芽孢杆菌；抑菌物质；脂肽 　　人参Panax ginseng C. A. Mey.为五加科人参属??年生药用植物，是我国传统名贵中药材，在国际上享有盛誉。目前，人参主要依赖人工栽培，在我国主要分布于长白山地区以及松花江、图们江、鸭绿江和新开河流域。东三省人参产量占世界人参产量一半以上，人参产业对促进地方经济增长有重要贡献[1]。野生变栽培后，病害逐年加重，成为困扰人参产业发展的突出问题。目前，人参病害防治主要依赖化学农药，由此导致的环境污染、农残超标、出口受阻等问题日益严峻，寻求更为环保、安全的生物防治手段是解决该问题的有效途径之一。内生菌生活在植物内部、受环境影响小，与外源生防菌相比有更稳定的防治效果[2]。本课题组从人参根中分离筛选出的内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ge25菌株对人参黑斑菌Alternaria panax、人参疫病菌Phytophthora cactorum、人参锈腐菌Cylindrocarpon destructans、人参菌核菌Sclerotinia schinseng等人参致病菌具有理想的抑菌活性[3]。在此基础上，本文以人参黑斑菌为靶标菌，对ge25菌株在不同培养基中的发酵粗提物进行抑菌活性比较及稳定性研究，进一步以菌株发酵物中的抗菌脂肽为研究目标，通过薄层色谱分析、原位酸水解和生物自显影技术对脂肽类物质结构特征进行定性分析，采用对峙培养法检测其对多种人参致病真菌的抑制效果，为揭示该菌株的抑菌机理及抑菌活性物质提取奠定理论基础，也为生防菌剂开发提供理论指导。 　　1材料 　　1.1供试菌株 枯草芽孢杆菌B. subtilis ge25菌株由本实验室保存；人参黑斑菌A. panax、人参锈腐菌C. destructans、人参灰霉菌Botrytis cinerea由吉林农业大学中药材学院提供。 　　1.2培养基 PDA培养基：鲜土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。LB培养基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。Landy培养基：葡萄糖20 g，谷氨酸5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，MnSO4 5 mg，CuSO4?5H2O 0.16 mg，FeSO4?7H2O 0.15 mg，蒸馏水1 L，pH 7.0。 　　2方法 　　2.1菌株发酵上清液的制备 参考王帅等[4]的研究方法，用接种环挑取1环经活化的ge25菌株，接种至100 mL的LB液体培养基中，33 ℃，160 r?min-1振荡培养24 h，作为种子液。按5%接种量将种子液分别接种到100 mL的LB和Landy液体培养基中，相同条件振荡培养48 h，发酵液4 ℃，1万 r?min-1离心20 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤得发酵上清液，4 ℃保存、备用。 　　2.2粗蛋白及粗脂肽提取物的制备及其抑菌活性 向10 mL LB发酵上清液中缓慢加入固体硫酸铵颗粒，使其饱和度分别达到30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，4 ℃静置过夜，1万r?min-1离心20 min。沉淀用0.02 mol?L-1的PBS缓冲液（pH 7.2）重悬至完全溶解，所得溶液装入透析袋（截留相对分子质量8～14 kDa）中除盐，直至1%的BaCl2溶液滴定透析外液无沉淀生成。将透析袋内溶液冷冻干燥，PBS缓冲液定容至10 mL，经0.22 μm滤膜除菌，得粗蛋白提取液。 　　分别取LB和Landy发酵上清液各10 mL，6 mol?L-1的HCl调节至pH 2.0，4 ℃静置过夜，1万 r?min-1离心20 min。沉淀用甲醇溶解，抽滤2次，滤液经旋转蒸发浓缩后再冷冻干燥，用PBS缓冲液（0.02 mol?L-1，pH 7.2）定容至10 mL，经0.22 μm滤