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砷超富集植物蜈蚣草丛枝菌根观察方法优化 　　摘要：为了便于蜈蚣草菌根结构的观察及侵染状况的测定，研究根系组织透明（脱色）流程优化及采用酸性品红乳酸液、曲利苯蓝、蓝黑醋酸墨水（北京牌）和纯黑醋酸墨水（Quink牌）4种染液处理对菌根染色效果的影响，以优化蜈蚣草丛枝菌根观察的脱色条件及染液染色方法。结果表明，采用20%KOH于90 ℃水浴60 min、碱性H2O2处理 45 min 的方法对根系的脱色效果最好；采用醋酸墨水染色，菌丝、泡囊、丛枝的染色效果明显。研究结果将为观察蜈蚣草菌根提供技术指导，方便测定真菌侵染状况，从而为进一步研究丛枝菌根真菌对砷在蜈蚣草体内的迁移转化提供方法指导。 　　关键词：砷；超富集植物；丛枝菌根；蜈蚣草；共生体系；观察；优化 　　中图分类号： Q944.54；Q949.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0236-03 　　丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，简称AM）形态结构观察是从事菌根研究的一项基础工作，是后期丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizae fungi，简称AMF）鉴定、植物侵染率测定等相关研究的必经环节。目前用于菌根观察的方法主要是染色镜检法[1]，其操作简便、易于观察，主要步骤为固定、透明、染色、分色、制片和观察，其中根系透明、染色是关键步骤。一般植物根系采用5%～10%KOH溶液于90 ℃透明处理 20～60 min即可达到满意的效果。但不同的植物其根系生长状况不同，因而KOH浓度及处理时间也不同。AM染色的方法有多种，目前使用最多的染色液是酸性品红和曲利苯蓝[1]。 　　蜈蚣草是一种砷超富集植物[2]，具有极强的吸收砷特性，已经广泛应用于砷污染土壤的修复中[3]，已有在蜈蚣草中发现丛枝菌根的报道[4]。AM真菌侵染能提高根际土壤砷酸还原酶的活性，利于砷酸盐转换为亚砷酸盐，促进砷从蜈蚣草根部转移到地上部，明显提高蜈蚣草地上部中砷含量，从而提高蜈蚣草的砷修复效率[5-7]。但是，蜈蚣草根系中单宁含量高[8]，根系木质化、偏硬，颜色较深，在菌根观察过程中不易于根系脱色，对后期染色后的观察产生严重干扰。针对此问题已有相关报道，如Trotta等采用10% KOH于60 ℃透明处理60 min，并置于室温下处理1周[8]；刘逸竹采用10% KOH于95 ℃保温30～60 min[9]；Wu等采用10% KOH于 90 ℃ 处理60 min，并用新配的碱性H2O2处理20～60 min[10]。总体来看，不同研究者所采取的方法不同，其观察效果存在很大不同，且研究结果间缺乏可比性，这在很大程度上影响了蜈蚣草丛枝菌根的相关研究。因此本研究旨在通过优化蜈蚣草菌根透明条件以及选用不同的染色液来探究蜈蚣草最适的菌根观察方法，在此基础上标准化蜈蚣草菌根观察方法，并为侵染率测定及后续砷在丛枝菌根-蜈蚣草共生体系中的迁移转化研究提供方法支撑。 　　1材料与方法 　　1.1植物材料 　　供试蜈蚣草于2015年7月采自广西刁江沿岸金城江区某地土壤砷污染修复基地，为大田生长1年的蜈蚣草植株。用自来水轻轻冲洗根系，除去黏着的土壤，得到干净的根系；用滤?吸干水分，挑选200 g较嫩的根系，置于50%乙醇溶液中保存，常温放置备用。 　　1.2试验试剂 　　主要试剂：乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，分析纯）；HCl（沈阳市新光化工厂，分析纯）；KOH（Kermel，分析纯）；H2O2（KESHI，分析纯）；氨水[重庆川东化工（集团）有限公司，分析纯]。染色剂：酸性品红（CHEMICAL）；曲利苯蓝（天津博迪化工股份有限公司，分析纯）；蓝黑醋酸墨水（北京牌）；纯黑醋酸墨水[Quink（派克）牌]。 　　1.3组织透明及染色 　　1.3.1组织透明（脱色）取15支5 mL玻璃试管，编号1～15，分为3组，将根系剪成小段（1 cm左右）后均分置于试管中，分别向1～5、6～10、11～15号试管中加入10%、15%、20%KOH溶液，置于90 ℃水浴锅中水浴60 min，随后每组分别进行以下处理：室温下过夜（CK），用碱性H2O2处理30、45、60 min。 　　1.3.2漂洗将溶液倒掉，待试管冷却后用清水将根段冲洗3次。 　　1.3.3酸化向试管中加入2% HCl，对根段进行酸化，以促进染色，5 min后将HCl倒掉。 　　1.3.4染色将每支试管的根均分为3组，每组分别用 0.1 g/L 酸性品红乳酸液（1 L溶液中含874 mL乳酸、63 mL甘油、63 mL去离子水、0.1 g酸性品红）、曲利苯蓝染色液（1 L 溶液中含300 mL乳酸、300 mL甘油、0.65 g曲利苯蓝）、5%醋酸墨水溶液（含95 mL食醋、5