肠道内硫酸盐还原菌的多样性分析-生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:刘辰雷 日期]: 户!J 年 2 月二Y日 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在一一年解密后适用本授权书。 不保密团。 (请在以 k 方框内打 u .j ) 学位论文作者签名:刘具雪 指导教师签名 ，k 日期:叫年 2 月 2月 日期: ?)oI乡年 d 月 ìt 口 上海交通大学理学硕士学位论文 摘要 肠道内硫酸盐还原菌的多样性分析 摘 要 硫酸盐还原菌（sulfate reducing bacteria, SRB）是一类以硫酸盐为 呼吸链终端电子受体从而氧化有机物和氢气以获取能量的一类厌氧微 生物。硫酸盐还原菌不仅抑制丁酸盐的产生，而且消耗肠道内已有的 丁酸盐；硫酸盐还原菌的主要产物之一是硫化氢（H2S），它调节胰岛 素的分泌、抑制丁酸盐的氧化、影响动物细胞的呼吸、对动物细胞有 遗 传 毒 性 和 细 胞 毒 性 ； 革 兰 氏 阴 性 菌 硫 酸 盐 还 原 菌 的 脂 多 糖 （lipopolysaccharide，LPS）诱发炎症的能力强。硫酸盐还原菌的这些 特性都表明它可能是肠道内具有重要功能的一类细菌。已有报道显示 SRB 可能与结肠炎、结肠癌、肠道易激综合征、代谢综合征等疾病的 发生发展有关。 本研究的第一部分内容是建立肠道硫酸盐还原菌的 DGGE 分析技 术。依据文献挑选了两对硫酸盐还原菌腺苷酰硫酸还原酶α亚基基因 （adenosine-5-phosphosulfate reductase alpha subunit gene, aprA）的特 异 性 引 物 ： AprA-1-FW/ AprA-5-RV 和 AprA-3-FW/ APS-RV 。从 GenBank 中下载了 13 株脱硫弧菌科细菌的 aprA 的序列，利用 Clustal X、 Simulated PCR（SPCR）软件比较、评估了这 2 对引物用于扩增粪便样 品中的 SRB 的特异性。它们的结果均表明引物 AprA-3-FW/ APS-RV I 上海交通大学理学硕士学位论文 摘要 优 于 AprA-1-FW/AprA-5-RV 。 实 际 PCR 的 结 果 也 显 示 AprA-1-FW/AprA-5-RV 扩增效率低并有非特异扩增。在此基础上建立 DGGE 体系，对 10 例健康人肠道中 SRB 的分析显示，每个个体肠道 中 SRB 的种类有 1 到 5 种不等，这表明基于 aprA 序列的 DGGE 技术 是分析肠道 SRB 组成的有效方法。 本研究的第二部分内容是分离培养人肠道中的 SRB 菌株并分析其 多样性组成。选择 1 名糖尿病患者（D）、1 名健康老年人（S）和 1 名 健康青年人（H）作为分菌对象，采集新鲜粪便样品进行 SRB 的分离。 从糖尿病患者样品中分离得到了 150 株 SRB 菌株分属 4 种 ERIC-PCR 型；从健康老年人样品中分离到 96 株 SRB 菌株，分属 2 种 ERIC-PCR 型；健康青年人志愿者的样品中未能分离到 SRB 菌株。对分离株的代 表菌株进行 16S rRNA 基因全长和 aprA 基因片段的测序，通过 GenBank Blast 、 系 统 进 化 树 等 分 析 确定 这 些 菌 株 都 属 于 脱 硫 弧 菌 属 （Desulfovibrio）细菌。本研究也对 3 名志愿者肠道中的 SRB 组成进 行了 aprA 基因的克隆文库分析和 DGGE 分析，并与培养的结果进行 了比较。结果显示，从糖尿病患者样品中分离到的 SRB 菌株与 D. intestinalis 99%相似，是该样品中 SRB 的一种优势种；从健康老年人 样品中分离到的菌株与 D. desulfuricans 99%同源，是该样品中最主要 的一种 SRB；健康青年人样品虽未分离到 SRB 菌株，但分子检测显示 其含有 D. d