肠道病毒71型3Cpro蛋白可视化重组病毒的构建与应用-微生物学专业论文.docxVIP

目录 目录 目 录 英文缩略词表 1 摘 要 2 Abstract 5 前 言 9 第一部分：EV71 病毒基因组全长感染性 cDNA 克隆的构建与鉴定 14 第二部分：EV71 3Cpro 蛋白实时可视化重组病毒的构建与鉴定 33 第三部分：EV71 3Cpro 蛋白在感染过程中的实时动态分析 53 总 结 65 参考文献 66 附录：主要溶液的配制 70 在读期间撰写的论著 71 个人简历 80 致 谢 81 英文缩 英文缩略词表 PAGE PAGE 1 英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 Amp ampicilin 氨苄青霉素 bp base pair 碱基对 kd kilodalton 千道尔顿 cDNA complementary DNA 互补 DNA CPE cytopathic effect 致细胞病变效应 DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 HFMD hand-foot-mouse disease 手足口病 IFA indirect immunofluorescence assay 间接免疫荧光试验 IRES internal ribosome entry site 内部核糖体进入位点 mRNA messenger RNA 信使 RNA kb kilobase pair 千碱基对 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM 培养基 PBS phosphate-buffered saline 磷酸缓冲盐溶液 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 RNasin ribonuclease Inhibitor RNA 酶抑制剂 rpm rotation per mintute 每分钟转数 RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链反应 TC tag tetracysteine tag 四半胱氨酸标签 UTR untranslated region 非编码区 摘 摘 要 摘 要 肠道病毒 71 型（EV71）是小 RNA 病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属 （Enterovirus）的重要成员。EV71 感染主要引起手足口病（Hand-Foot-Mouse Disease），可导致严重的神经系统综合症，是手足口病重症和死亡病例的主要 原因。目前临床 上尚 无针对 EV71 的有效 疫苗和特 异抗病 毒药 物。 EV71 病毒基因组为单股正链 RNA 分子，包含一个单一读码框，编码 4 个 结构蛋白（VP1，VP2，VP3，VP4）和 7 个非结构蛋白（2A，2B，2C，3A，3B， 3C 和 3D）。基因组 5′和 3′端为非编码区（untranslated region，UTR），5′UTR 内含有内部核糖体进入位点（IRES）等复制翻译调控元件，3′UTR 内含有三个 茎环结构和 PolyA 元件。非结构蛋白 3C 蛋白酶（3Cpro）是病毒基因组编码的两 个蛋白酶之一，主要负责除 VP1-2A、 VP2-VP4 位点以外，病毒多聚蛋白其它 位点的切割。此外，3Cpro 还可对部分宿主蛋白进行切割，是病毒-宿主相互作用 过程中的关键蛋白。但目前对于 3Cpro 在宿主细胞内的表达与转运机制尚不清楚， 迫切需要明确 3Cpro 在感染过程中的时空动态分布情况，为后续研究奠定基础。 利用反向遗传学技术，本研究构建了 EV71 国内流行株基因组全长感染性 cDNA 克隆，并对恢复病毒进行了鉴定；双砷-四半胱氨酸成像技术是近年来新 兴的蛋白荧光标记技术，可以对带有 CCPGCC 多肽序列（TC 标签）的蛋白进行 实时荧光成像，因此我们在全长感染性 cDNA 克隆的基础上构建了在 3Cpro 标记 有 TC 标签的重组病毒，并对该病毒的生物学性质进行了鉴定；最后利用双砷- 四半胱氨酸成像技术对重组病毒进行了实时成像，获得了 3Cpro 在宿主细胞内表 达与转运的动态图像，明确了 3Cpro 在感染细胞内的时空分布特征。 1. EV71 基因组全长感染性 cDNA 克隆的构建与鉴定 首先，基于 EV71 国内流行株，构建了 EV71 基因组全长感染性 cDNA 克隆。 利用高保真 DNA 聚合酶，将病毒基因组进行全长 RT-PCR 扩增，同时在基因组 5′端上游引入 SP6 启动子序列和 SnaB I 单克