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植物基因靶向整合技术的研究进展 　　摘要：基因打靶作为反向遗传学的基础工具，可以对基因进行精确修饰或替?Q，从而改变生物的遗传特性。然而将基因打靶应用于高等植物方面的研究中却存在着打靶效率过低的问题。讨论了目前几种对植物基因打靶有效的试验方法包括转ＲＡＤ５４基因、锌指核酸酶（ＺＦＮ）以及正负筛选的方法。这些方法将使基因打靶应用在植物中成为可能。 　　关键词：基因打靶；ＲＡＤ５４；锌指核酸酶；正负筛选 　　中图分类号：Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）17－3476-04 　　 　　Research Progress of Gene Targeting in Plant 　　 　　ＫＡＮ Ｇｕｏ－ｓｈｉ１，ＭＡ Ｘｉａｏ－ｌｕ１，２，ＬＩ Ｓｈａｎ－ｓｈａｎ２，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｌｉｎｇ１，ＬＩＵ Ｙｕ－ｈｕｉ２ 　　（１． Sｃｈｏｏｌ ｏｆ Lｉｆｅ Sｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１，Ｃｈｉｎａ； 　　２． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ａｓ ａ ｂａｓｉｃ ｔｏｏｌ of ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｃould ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｓｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅ， ｗｈｉｃｈ ｃould ｃａｕｓｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｉｓ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ． Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｌａｎｔｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＲＡＤ５４， ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＺＦＮ） ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ were discussed． Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｄｅ ｉｔ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｏ ａｐｐｌｙ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｌａｎｔｓ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ； ＲＡＤ５４； ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ； ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ 　　 　　基因打靶是指外源ＤＮＡ与受体细胞染色体ＤＮＡ上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，从而改变细胞遗传特性的方法［１，２］。基因打靶可以作为反向遗传学的基础工具，利用基因打靶技术，可将某个基因敲除（Ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ），使之失去功能，继而分析研究该基因编码蛋白的功能。同时利用基因打靶，也可精确修饰或替?Q靶基因。其依赖同源重组完成对特定基因的修改。 　　目前对于基因打靶的研究已有许多成功的例子，如有科学家利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现获得了重大成果。此外人们在酵母、拟南芥、水稻和烟草上都成功地实现了基因打靶。其中，酵母几乎１００％是通过基因打靶方式实现基因插入的，外源ＤＮＡ片段可以很精确地插入相应的同源位置。人们在研究小鼠胚胎干细胞的基因打靶时，打靶频率可达到１％，但水稻、烟草的基因打靶频率只有０．００１％～０．０１０％。 　　１同源重组 　　同源重组作为基因打靶的细胞学基础，其原理对于基因打靶的研究具有重要意义。但目前并不完全了解同源重组的具体过程。根据试验先后提出了几种同源重组模型。 　　１．１Ｈｏｌlｉｄａｙ模型 　　２０世纪６０年代，由Ｈｏｌｌｉｄａｙ等［３］提出的Ｈｏｌｌｉｄａｙ模型。该模型认为两个ＤＮＡ分子中，通过在两个ＤＮＡ分子的同一部位两个单链的断裂而引发重组。然后两个断裂的单链同另一分子的互补序列配对形成两个异源双链，称为Ｈｏｌｌｉｄａｙ连接体的结构，它由两个双链分子通过其交?Q的链连在一起。该模型以杂合ＤＮＡ链的形成和随后的ＤＮＡ修复解释真菌中的基因转化现象，从而建立了同源ＤＮＡ序列间遗传信息交?Q的基本概念。 　　１．２Ｍｅｓｅｌｓｏｎ－rａｄｄｉｎ