雌激素对心肌L型钙通道及钠钙交换体的调控作用及其机制研究-药理学专业论文.docx

华中科技大学同济医学院博士学位论文 华中科技大学同济医学院 博士学位论文 - - 3 - 雌激素对心肌 L 型钙通道及钠钙交换体的调控作用 及其机制研究 华中科技大学同济医学院药理学系 2010 届博士研究生 杨晓燕 指导教师 曾繁典教授 中文摘要 目的：长 QT 综合征（Long QT Syndromes，LQTs）是由基因突变或药物等因素 延长心肌细胞复极所致的临床综合征，易诱发尖端扭转性室性心动过速（torsade de pointes，TdP），导致发作性晕厥、甚至心脏猝死。成年女性患者更易发生致 死性的 TdP。然而在幼年时，体内性激素显著增高前（男孩14 岁，雄兔42 日 龄），雄性发生 TdP 的风险明显高于相应的雌性个体，这一心律失常表型的性 别差异在青春期之后发生逆转。已有研究提示，雌激素是影响 TdP 易感性的重要 因素。L 型钙通道（L type calcium channel，Ca-L）功能上调可能与 LQTs 时心律 失常易感性在成年后的逆转及 EAD 发生率的性别差异有关。钠钙交换体（sodium calcium exchanger，NCX）亦可能在其中发挥一定作用。在本研究中，我们观察 性别、年龄和心肌部位诸因素对 NCX 表达的影响，并探讨雌激素调控 Ca-L 及 NCX 功能的作用及其作用机制。 方法：（1）采用主动脉逆流灌注和消化酶解方法，获得单个家兔心室肌细胞。根 据实验需要，用雌激素等不同药物孵育心肌细胞。采用全细胞膜片钳技术在电压 钳模式下记录 ICa-L，免疫组化法分析 Cav1.2α 蛋白表达水平，单细胞实时定量 RT-PCR 检测 Cav1.2α mRNA 表达，以探讨雌激素对 Ca-L 功能的调控作用及其 作用机制。在电流钳模式下记录动作电位，并以多非利特诱发 EAD，以研究雌 激素对 LQTs 时心律失常易感性的影响。（2）如（1）方法分离幼年及成年家兔 心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录钠钙交换电流（Sodium calcium exchanger current ， INCX ）。 收集 幼年 及成年 家兔心 肌组 织，采用 western-blot 方法分析 NCX 蛋白表达。在 Langendorff 灌流的家兔心脏上，采用 - - PAGE 4 - 同步光学标测膜电位及细胞内钙，利用 NCX 抑制剂 KB-R7943，评估 NCX 对 E4031 致心律失常作用的影响。（3）如（1）方法获得单个家兔心室肌细胞。根 据实验需要，采用雌激素等不同药物孵育心肌细胞。采用全细胞膜片钳技术在电 压钳模式下记录 INCX，免疫组化法分析 NCX1 蛋白表达水平，以探讨雌激素对 NCX 功能的调控作用及其作用机制。雌激素或 DMSO 孵育 24 h 后，在电流钳模 式下记录动作电位，并以多非利特诱发 EAD，利用 NCX 抑制剂 KB-R7943，以 评估 NCX 对雌激素增加 LQTs 时心律失常易感性作用的影响。 结果：（1）与对照组相比，雌激素孵育 24 h 后心底部心外膜下心肌细胞 ICa-L 显 著增加（p0.05），但雌激素并未改变 ICa-L I-V 曲线的形状；孵育 48 h 和 72 h 后， 雌激素进一步增加 ICa-L 电流密度（p0.01），但并不改变 Ca-L 的通道门控。生 理浓度范围内的雌激素（0.1~1 nM）可浓度依赖性的增加心外膜下心肌细胞 ICa-L， 而孕激素无此作用。雌激素可受体依赖性的上调 ICa-L，其作用主要由雌激素受体 α 介导。雌激素孵育 24 h 后 Cav1.2α 的 mRNA 表达和蛋白表达水平均明显增加。 雌激素与转录抑制剂放线菌素 D（actinomycin D，AD）和翻译抑制剂放线菌酮 （cyclohexmide，HX）共同孵育后，雌激素上调 ICa-L 的作用被抑制。雌激素孵 育 24 h 后，多非利特诱发心肌细胞发生 EAD 的风险增加，且此作用具有雌激素 受体依赖性。（2）成年 雄兔心底部（1.76±0.27 pA/pF），心尖部（1.70±0.30 pA/pF） 以及雌兔心尖部（1.30±0.50 pA/pF）INCX 的电流密度相似，但雌兔心底部 INCX 的 电流密度（2.59±0.32 pA/pF）明显升高，与雄兔心底部及两种性别家兔心尖部 INCX 的电流密度相比有统计学差异（p0.05）。雌性幼兔心底部（1.21±0.25pA/pF）和 心尖部（1.28±0.28pA/pF）INCX 的电流密度相似（p=0.84），而雄兔心底部 INCX 的电流密度（3.96±0.35 pA/pF）明显升高，与雄兔心尖部（2.61±0.43 pA/pF）以 及雌兔心尖部和心底部 INC