肝胰腺细小病毒病流行情况初步调查及病原核酸与核衣壳蛋白亲和筛选探究-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海 上海海洋大学硕士学位论文 I I 肝胰腺细小病毒病流行情况初步调查及病原核酸与核衣壳蛋 白亲和筛选探究 摘 要 肝胰腺细小病毒（Hepatopancreatic parvovirus, HPV）是引起对虾 疾病的重要病原之一，在病毒分类中属于细小病毒科（Parvoviridae）， 浓核病毒亚科（Densovirinae）。主要的对虾养殖品种都是HPV的自然宿 主，在中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）中尤为常见，病毒感染 可导致幼虾死亡或引起矮小残缺综合症（RDS），蟹类等其他甲壳类 动物也可携带并传播该病毒。HPV核酸为单链线性DNA，基因组大小 约6 kb，由单一核衣壳蛋白包裹。病毒粒子无囊膜，正二十面体形，直 径22~23 nm。基因组有3个开放阅读框（ORF），编码2个非结构蛋白和 1个结构蛋白——核衣壳蛋白。目前，GenBank数据库中已提交的HPV 全 基 因 序 列 有 5 条 ， 分 别 为 泰 国 株 （ DQ002873 ）、 澳 大 利 亚 株 （DQ458781）、印度株（FJ410797）、中国株（GU371276）和韩国株 （JN082231）。HPV不同地理株的基因序列分析数据表明HPV基因组存 在较多的遗传变异情况。 目前，针对HPV的检测方法主要采用国际上通用的组织病理学观 察，常规PCR检测法等；已报道的real-time PCR检测法，由于引物及探 II II 针序列的差异，不适用于HPV中国地理株。因此，本研究以HPV中国 株基因序列为主要依据，设计引物和TaqMan探针，建立real-time PCR 检测法，并应用于样品检测。本实验室已经建立了HPV核衣壳蛋白的 原核重组表达系统，在此基础上，依据单链核酸具有功能性天然构象 与核衣壳蛋白存在特异性识别能力并产生选择性装配机制这一特性， 运用指数富集的配基系统进化（SELEX）技术，进行HPV核酸与核衣 壳蛋白亲和筛选探究。 本研究的主要内容包括： 1、样品调查与分析。在2011年5月至2012年10月期间，在山东半 岛及环渤海主要对虾养殖地区进行了流行病学调查，采集数百份样品， 主要运用了现场诊断技术，病原检测试剂盒，组织病理学观察，普通 PCR法，real-time PCR法等手段，进行病原检测。对于疫病流行病学调 查及疾病的防控和预警提供了有力的科学依据，具有重要的意义。 2、HPV中国株real-time PCR检测方法建立和应用。根据HPV中国 株基因组序列，设计了一对引物及TaqMan探针，进行real-time PCR反 应体系优化、特异性分析、标准曲线构建及灵敏度分析、重复性分析， 并应用于样品检测。分析结果表明：新建立的HPV real-time PCR检测 法灵敏特异，重复性良好，适合HPV中国株的检测。临床应用检测结 果显示：所检样品中，中国明对虾HPV阳性率高达76%，且具有较高的 病毒拷贝数，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）HPV阳性率很低， 且检出的病毒拷贝数也低；HPV强阳性的样品，其养殖水体中的其他 PAGE PAGE VI 环境生物甚至养殖海水中也检出HPV。 3、HPV核酸与核衣壳蛋白亲和筛选探究。利用AKTA explorer 100 完成重组表达的HPV核衣壳蛋白的纯化、复性，使用超声随机打断的 方法构建HPV基因组随机dsDNA库，尝试利用指数富集的配基系统进 化(SELEX)技术筛选与HPV核衣壳蛋白高亲和的DNA片段。本节实验 成功探索出完整的该病毒蛋白与核酸亲和筛选的实验方法，对于今后 的深入研究提供了参考依据。 关键词：肝胰腺细小病毒，调查分析，real-time PCR，基因组SELEX， 亲和筛选 Preliminary investigation of the prevalence of Hepatopancreatic parvovirus disease and affinity screening exploration between HPV nucleic acids and nucleocapsid protein ABSTRACT Hepatopancreatic parvovirus (HPV) is one of the major pathogens that cause diseases in penaeid shrimp, belonging to the Parvoviridae family, Densovirinae subfamiliy. Major cultured penaeid shrimp (Fenneropenaeus chinensis especially) are na