葛根素抗心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用机制研究-药理学专业论文.docxVIP

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 目的：葛根素是一种葛根豆科植物中提取的黄酮苷类成分，研究表明：葛 根素具有抗心肌缺氧复氧损伤的保护作用，属于药理学的研究热点。蛋白激酶 Cε （protein kinase Cε, PKCε）属于依赖磷脂的丝/苏氨酸激酶家族，其各种亚型参 预了细胞凋亡等多种细胞内病理生理功能的调控，是重要的内源性心肌保护因 子之一。本实验采用了新生 Sprague-Dawley（SD）大鼠原代心肌细胞，成功地 建立缺氧/复氧（A/R）损伤模型，探讨 PKCε 蛋白表达与葛根素抗心肌细胞缺氧 复氧损伤的保护作用之间的关系。 方法：选取新生 SD 大鼠原代心肌细胞，随机分为五组，每组重复六次：（1） 正常对照组(Con)、（2）缺氧/复氧组（A/R）、（3）葛根素+A/R 组(Pue+A/R)、 （4）葛根素+抑制剂+A/R 组(Pue+εV1-2+A/R)、（5）抑制剂+A/R 组(εV1-2+A/R)。 采用 MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法测定实验各组细胞的存活率，Western blotting （免疫印迹）法测定 PKCε 蛋白表达水平，酶联免疫法测定各组细胞上清中乳酸 脱氢酶(LDH)、肌酸肌酶(CK)、细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧 化物酶(GSH-Px)的活性和丙二醛(MDA)的含量，采用流式细胞仪测定细胞内活 性氧（ROS）含量、线粒体膜电位（Δψm）变化、细胞凋亡水平。 结果：葛根素预处理 24h 后，成功建立缺氧复氧损伤的心肌细胞中 PKCε 表达水平呈剂量依赖性上调(P0.01)，且与 A/R 组相比，320μM 葛根素预处理组 细胞存活率升高最显著，PKCε 蛋白表达上调最明显；从细胞培养基收集的上清 中可看出，CK 和 LDH 活性下降，细胞内 SOD、GSH-Px 活性增强，MDA 含量 下降，细胞内 ROS 含量明显减少，线粒体膜电位稳定性增加，细胞凋亡量减少， 与 A/R 组相比，均具有显著性差异(P0.01)；PKCε 特异性抑制剂 εV1-2 的加入 能显著削弱葛根素的抗缺氧复氧损伤的心肌保护作用。 结论：葛根素抗 A/R 损伤的保护作用依附于 PKCε 信号通路，至少部分地 依赖于 PKCε 表达程度增加。 关键词：葛根素；PKCε；缺氧复氧；心肌保护 资助项目：国家 973 科技计划专项课题( 2009CB526405) I Abstract Abstract ABSTRACT Objective：Puerarin, a flavonoid glycosidesis, extracted from bean plant kudzu, had been proved to protect cardiomyocytes from cardiomyocytes anoxia/reoxyg- enation injury. PKCε is one of the important endogenous myocardial protective factors, is involved in intracellularphysiopathology functions. In our study, we have established the cultured neonatal rat primary cardiomyocytes model with the acute myocardial anoxia/reoxygenation (A/R) injury model to explore the relationship between the protective effect of puerarin against myocardial anoxia/reoxygenation injury and the PKCε signal pathway. Methods:The cultured primary cardiomyocytes were divided into five groups randomly, each group repeated six times: (1)Control group; (2) A/R group; (3) Pue+A/R group; (4) Pue+εV1-2+A/R group. (5) εV1-2+A/R group.The western blotting analysis assayed the expression of PKCε and the cell viability was detected by MTT, The results of MDA content，the activit