葛根素通过细胞凋亡途径干预帕金森病模型的研究-药理学专业论文.docx

安徽医科大学博士学位论文 安徽医科大学博士学位论文 4 4 细胞的凋亡过程中的作用；通过给予 6-OHDA 单侧注射损毁黑质神经元建立 PD 大鼠 模型，研究葛根素对 PD 模型大鼠的影响，进一步探讨葛根素的作用机制。 2 方法 2.1 台盼蓝染色法检测细胞存活率和形态学观察 葛根素预处理后培养的 SH-SY5Y 细胞和 1mM MPP+作用 48 h 后台盼蓝检测。后 续实验中分组如下：空白对照组、模型组（1mM MPP+组）和不同浓度的葛根素药物 组（12.5 μM puerarin+1mM MPP+组，25 μM puerarin+1mM MPP+ 组，50 μM puerarin+1mM MPP+组）。 2.2 JC-1 流式细胞检测线粒体膜电位 葛根素造模 24h 后进行 JC-1 染色，流式细胞仪分析。 2.3 ELISA 检测胞浆细胞色素 C 的含量 各组细胞培养 24 小时，达到密度为 2x106 cells/ml。ELISA 试剂盒检测细胞色 素 C 的含量，Bradford 法检测蛋白的浓度。 2.4 Western blotting 检测 Cyt c 蛋白的表达 细胞造模 24 小时后进行胞浆蛋白的提取和定量，SDS 垂直电泳，获得凝胶；含 样品的凝胶进行电转移后开展免疫学实验，免疫学：封闭 PVDF 膜 l h 后，加入 Cyt c 单克隆抗体，常规加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG(二抗)， ECL 检测试剂 与膜作用暗室中曝光，X 线显影、定影。凝胶成像系统进行分析。 2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 各组细胞造模 48 h 后，按照试剂盒说明书，进行染色，流式细胞仪检测细胞 周期和细胞的凋亡率。 Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 酶活性的检测 按试剂盒说明完成。各组细胞造模 24 小时后，细胞密度为 2x106 cells/ml 。离 心收集细胞后冰浴裂解。设置反应体系，加入 Ac- DEVD -pNA(2mM)后 37℃孵育 60-120 分钟。颜色变化比较明显时即可测定 A405。蛋白浓度测定 Bradford 法检测。 Caspase-8酶活性的检测：方法同上，反应体系的特异性底物为Ac- IETD –pNA。 Caspase-9酶活性的检测：方法同上，反应体系的特异性底物为Ac-LEHD –pNA。 5 5 DNA Ladder 检测 细胞加药处理 48 h 后，裂解细胞、提取基因、灭活核酸酶，消化蛋白质和 RNA， 选择性分离基因组 DNA 与凋亡 DNA ladder，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍摄。 2.8 动物实验 6-OHDA 立体定位注射手术造模成功的大鼠分为 A 组(空白对照组)、B 组(假手 术对照组)、C 组(6-OHDA 模型组)；D 组（(6-OHDA 模型+低剂量葛根素处理组）和 E 组（6-OHDA 模型+高剂量葛根素预处理组）。低剂量葛根素为 40mg?Kg-1/day 葛根素 腹腔注射，高剂量为 120mg?Kg-1/day 葛根素腹腔注射。连续 10 天。 在 6-OHDA 注射术后的第 34 天，每组取 2 只用于透射电镜观察。其余按常规灌 注、取脑、固定，制作蜡块和中脑黑质、纹状体切片，用于检测黑质区的 HE，TH-IHC， TH-ISHH,Tunel，Bcl-2，Bax，和纹状体的 GDNF 表达实验。 实验操作按常规办法进行。采用形态学显微图像分析系统进行半定量分析。 2.9 数据统计 细胞学各组实验均设置复孔并重复 3 次。数据采用均值±标准差( x ±s)，检验 方法：组间均数比较检验采用 t 检验；多组间均数比较检验采用单因素方差分析。 采用 SPSS11.0 统计分析软件，p0.05 为有显著差异，p0.01 为有非常显著差异。 3 结果 葛根素预处理后 MPP＋作用 SH-SY5Y 细胞的活性 MPP+作用的 SH-SY5Y 细胞活性随着 MPP+浓度增加显著降低，当 MPP+剂量达到 1mM 以上时，与对照组比较，细胞活性相对为 56%(p0.05)。经葛根素预处理的细胞活 性与单纯 MPP+处理的细胞活性有显著性差异(p0.01)；说明葛根素能够提高 MPP+处 理的 SH-SY5Y 细胞存活率。用葛根素预处理后的细胞，对 MPP+ 的毒性具有较强的 保护作用，能够提高细胞的成活率。 线粒体跨膜电位 JC-1 和 Cyt c 检测结果 JC-1 染色流式细胞仪检测细胞的结果表明，单纯 MPP+处理的 SH-SY5Y 细胞，线 粒体膜电位显著下降，而加葛根素预处理的