九孔鲍cDNA文库的构建、四种重要免疫相关蛋白的发现及其功能研究-特种经济动物饲养专业论文.docx

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鋈盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：装纠记／答字吼阳J7年／月≯日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 灵别移 导师签名： 等字吼叫年∥月≯目 签字日期：砷7年彩月!日 摘要鲍是一类重要的经济贝类品种，但是近年来由于环境污染和病害的发生而导 摘要 鲍是一类重要的经济贝类品种，但是近年来由于环境污染和病害的发生而导 致鲍的产量大幅度下降。为了探索研究鲍免疫反应相关机制，为鲍病害防治提供 理论基础，本研究构建了九孔鲍血淋巴细胞eDNA文库，首次筛选出了4个尚 未报道的鲍免疫反应相关基因：组氨酸核苷结合蛋白、胞嘧啶核苷脱氨酶、泛素 连接酶Rbxl和胸腺肽p。并利用现代生物信息学分析手段，分子生物学、免疫 学及细胞生物学等技术对这4个鲍新基因的结构和功能进行了研究。 1．构建了九孔鲍血淋巴细胞eDNA文库 共得到310个EST序列，其中包含18个鲍新基因全长序列。通过生物信息 学软件分析，这些基因分别涉及到鲍的细胞代谢和生长、转录调控、物质合成、 免疫反应等。并把相关基因序列提交到GenBank数据库。 2．九孔鲍组氨酸核苷结合蛋白的鉴定与功能和机制的研究 九孔鲍组氨酸核苷结合蛋白(ab．HINT)cDNA全长为616 bp，氨基酸序列 与哺乳动物HINT有较高的相似度，并且包含三个保守的活性位点区域。组织表 达分布研究表明：ab—HINT在鲍不同组织中均有表达，表现了其功能的多样性， 并且在鲍血淋巴细胞和鳃中的表达水平要明显高于其他组织，暗示了ab．HINT 在鲍免疫反应中起到一定的作用。另外，LPS和Poly I：C的刺激均能诱导ab—HINT 的表达水平上升，进一步说明了ab—HINT在鲍免疫反应中的作用。为了进一步 研究ab．HINT的生物学活性及生理学作用，表达和纯化了ab．HINT蛋白，并利 用质谱技术鉴定。分析型超速离心机分析结果指明该ab．HINT是一个同源二聚 体。同时，高效液相色谱分析表明ab．HINT蛋白能够水解AMP．NH2。 利用制 备的抗体，用免疫组化和免疫荧光的方法，研究了ab．HINT在鲍组织细胞中的 表达定位。在这些研究的基础上，我们进一步探索研究了ab．HINT对鲍血淋巴 细胞及肿瘤细胞的凋亡作用及其作用机制。结果表明：ab，HINT能够诱导鲍血淋 巴细胞凋亡，有可能是通过凋亡调控因子P53来实现的。另外，ab．HINT能够增 加肿瘤细胞凋亡比例，该凋亡通路可能是通过上调P53的表达，同时伴随着抗凋 亡蛋白Bcl．2的下调和促凋亡蛋白Bax的上调来实现的。 3．九孔鲍胞嘧啶核苷脱氨酶的鉴定及功能研究 九孔鲍胞嘧啶核苷脱氨酶(ab．CDA)eDNA全长为1752 bp，氨基酸序列中 包含两个保守的活性位点区域和一个保守的半胱氨酸／组氨酸残基。序列比对 包含两个保守的活性位点区域和一个保守的半胱氨酸／组氨酸残基。序列比对 及进化树分析表明ab．CDA属于同源四聚体家族。组织表达分布研究表明： ab—CDA在鲍不同组织中均有表达，并且在鲍血淋巴细胞中的表达水平显著 高于其他组织。同时，LPS和Poly I：C的刺激均能诱导ab．CDA的表达水平 上升，说明了ab．CDA在鲍免疫反应中的作用。为了进一步研究ab．CDA的 生物学功能，表达和纯化了ab．CDA蛋白，并用质谱技术鉴定。分光光度计 分析表明该蛋白具有胞嘧啶核苷脱氨酶活性，同时，利用免疫组化的方法， 研究了ab．CDA在鲍组织细胞中的表达定位，结果表明：ab．CDA在胞质和胞 核均有表达。 4．九孔鲍泛素连接酶Rbxl的鉴定及功能研究 九孔鲍泛素连接酶Rbxl(ab—Rbxl)的eDNA全长为509 bp，氨基酸序列与 其他Rbxl同源物有较高的相似度，并且ab．Rbxl氨基酸序列中含有Rbxl蛋白 家族的特征区域ring box序列。组织表达分布研究表明：ab．Rbxl在鲍不同组织 中均有表达，并且在鲍血淋巴细胞中的表达水平相对高于其他